流式细胞技术（flow cytometry）-提供从动物/细胞建模、样本前处理、抗体配色、上机检测及数据分析的一站式整体解决方案

发布时间：2022-07-21 18:04:22 I 企业名称：北京乐博维康科技有限公司I 作者：乐博实验室

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实验设计

了解仪器配置

了解哪些荧光染料可以使用，哪些不可以使用

了解生物标志物

列岀感兴趣的标志物，并对其在细胞中的表达丰度和分布有一个总体的了解

流式配色基本原则

强弱搭配

选择干扰少的荧光组合
使分析的复杂程度降到最低
谨慎使用串联染料
注意环境因素对荧光素的影响

降低荧光干扰影响

受制于流式细胞仪的配置，出现荧光干扰在所难免。如何将这种影响降到最低呢？

首先，实验需要设置单阳对照，用于调节补偿。在做数据分析时，为了将这种荧光干扰降到最低，可以考虑将有溢漏的荧光素，放在相互排斥的Marker上。

其次，如果是共表达的Marker，在表达量高的情况下，是允许溢漏的。

最后，配色时需要考虑Marker的亲子代关系，子代可以向亲代溢漏，亲代不可以向子代溢漏。这么做是为了“使分析的复杂程度降到最低”。

如果目标Marker较少，比如三色、四色等，应尽量选择单体染料（例如：FITC、PE、APC等）。

如果检测Marker较多，或者流式细胞仪激光器受限，串联染料（PE/Cyanine5、PerCP/Cyanine5.5等）的使用，是非常有必要的。

大部分串联染料，在光照或者实验操作有“固定”步骤时，容易出现降解。所以，在实验过程中，要避免对串联染料进行固定，同时，要严格按照实验标准化流程操作，避免荧光素降解引起的实验问题。

除了刚才提到的光照和“固定”，容易对串联荧光素造成影响外，串联染料的长期孵育，也会对结果造成影响。因此，细胞染色后，请尽快安排上机检测，特别是在串联染料不便固定时。另外，FITC对低pH环境敏感，如果您的样本pH值较低，一定要注意避免使用FITC染料。

流式细胞术步骤

1).样品准备：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取肿瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；

2).对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；

3).按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；

4).依照软件提供的程序对检测结果进行定性定量分析；

5).检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。

样品制备

单细胞是流式细胞术对细胞进行分析检测的前提条件。在应用流式细胞术中，制备出合格的分散单细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它既要求组织分散成为单个细胞，又要维持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。

基本原则

1).保证各种液体和悬浮细胞样本新鲜，尽快完成样本制备和检测；

2).针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或者EDTA处理，以清除杂质，使黏附的细胞彼此分离形成单细胞状态；

3).对新鲜实体瘤组织可选用酶消化法、机械打散法或化学分散法来获得足够数量的单细胞悬液；

4).对石蜡包埋组织应先切成若干40-50μm厚的蜡片，经二甲苯脱蜡至水后，再用前述方法制备单细胞悬液；

5).单细胞悬液的细胞数不少于10⁷个/mL

外周血样品制备

1）常规血液样本制备

• 采集外周血，用肝素抗凝；采集后室温（25℃）保存，6h内处理；

• 红细胞裂解液（ACKbuffer）取出后，恢复至室温待用；

• 流式管内加入200ul外周血后，加入3mL的ACK buffer，室温孵育3至5 min；

• 加入10mL细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)终止红细胞裂解；

• 300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)重复洗涤一次；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x10⁷/mL备用。

2）外周血单个核细胞样本制备

• 采集外周血2mL，用肝素抗凝，用生理盐水将血液稀释成4mL，混匀；

• 15mL的离心管内，先加入等体积（4mL）的淋巴细胞分离液；

• 将稀释后的外周血沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液的液面上，勿用力过大，以免造成血液与分离液混合。务必保持清晰的分层状态；

• 400g室温离心20-30min（根据血液样本量确定离心条件，建议先摸索一下条件以达到最好的分离效果）；离心后可见试管内血液清晰的分为4层，上层为血浆层，第二次为白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，底层为红细胞层；

• 用吸管将第二层的淋巴细胞层小心的吸出收集到另1试管，用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)清洗2遍，每次300g离心5min；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x10⁷/mL备用。

骨髓细胞样品制备

1）常规骨髓细胞样本制备

• 无菌抽取骨髓液0.5mL，用肝素抗凝；

• 红细胞裂解液（ACKbuffer）取出后，恢复至室温待用；

• 骨髓液中加入3mL的ACK buffer，室温孵育3~5min；

• 加入10mL细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)终止红细胞裂解；

• 300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)重复洗涤一次；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x10⁷/mL备用。

2）骨髓液单个核细胞样本制备

• 无菌抽取骨髓液0.5mL；

• 将骨髓液标本中滴入含1000U/mL肝素抗凝剂的1mL PBS液中；

• 加入PBS稀释液将样本稀释至10mL；

• 15mL的离心管内，先加入5mL的淋巴细胞分离液；

• 用吸管吸取5mL的稀释后的骨髓液缓慢沿管壁加入淋巴细胞分离液的液面上；

• 400g室温离心20-30min（根据骨髓样本量确定离心条件，建议先摸索一下条件以达到最好的分离效果）；离心后可见试管内骨髓液清晰的分为4层，上层为PBS稀释液层，第二层为白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层；

• 用吸管将第二层的淋巴细胞层小心的吸出收集到另1试管，用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)清洗2遍，每次300g离心5min；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x10⁷/mL备用。

体液、灌洗液或悬浮细胞样品的制备

• 采集新鲜体液、灌洗液或悬浮培养细胞；

• 300g离心5min，收集细胞沉淀；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次；

• 若悬液中有明显的沉淀块，需用200~300目的滤网过滤后再用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)洗涤1~2次；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整浓度至1x10⁷/mL备用。

贴壁细胞的制备

• 吸除培养基上清液，用含无钙、镁离子的PBS漂洗一次；

• 以25mL培养基为例，加入1mL消化液（0.1%胰蛋白酶），置室温（25℃）或37℃消化2~
5min；或者加入1mL的EDTA（0.02%,pH7.4）冰上静置5~10min；

• 在倒置显微镜下观察，发现胞质回缩、间隙加大，立即吸除消化液并加入等倍体积含血清的培养基终止消化；

• 吸取瓶内液体，反复吹打瓶壁细胞。吹打动作要轻柔并尽量避免产生泡沫；

• 转移至离心管，300g离心5min，弃上清；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x10⁷/mL备用。

组织样品的制备

1） 剪碎研磨法：

• 将组织用PBS或无血清培养基漂洗干净；

• 将组织置于平皿中，用眼科剪剪成小颗粒（1~2mm3）；

• 用注射器针芯研磨成匀浆；

• 滴加适量的PBS或无血清培养基，用移液器吹打混匀；

• 经200~300目滤网过滤，300g离心5min，弃上清；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整浓度至1x10⁷/mL备用。

2）网搓法

• 将300目尼龙网扎在小烧杯上；

• 把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加PBS冲洗，直至将组织搓完；

• 收集细胞悬液，300g离心5min，弃上清；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整浓度至1x10⁷/mL备用。

3）研磨法

• 将组织剪成1~2mm3大小的组织块；

• 放入组织研磨器中，加入1~2mL的PBS；

• 转动研棒，研至匀浆；

• 加入10mL的PBS，冲洗研磨器；

• 收集细胞悬液，经200~300目尼龙网过滤，300g离心沉淀5min，弃上清；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整浓度至1x10⁷/mL备用。

注意：

1）以上方法为机械法，用于处理部分软组织例如胸腺、淋巴结等，对硬组织或纤维组织效果不好，并且对组织细胞有一定的损伤。

2）若组织为脾脏，可用研磨法处理后做红细胞裂解。在300g离心沉淀5min弃上清后，加入3mL的ACK buffer，室温孵育3~5min；再加入10mL细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)终止红细胞裂解；后续操作同研磨法。

4） 胰蛋白酶消化法：

适用于消化间质较少的组织，如上皮、肝、肾等组织，由于钙离子或血清会抑制胰蛋白酶的消化作用，此过程中使用的液体应不含这些离子或血清。消化时间根据不同情况进行调整，温度低、组织块大、胰蛋白酶浓度低，消化时间长；反之则缩短消化时间。胰蛋白酶常与EDTA（0.02%）等比例混合使用可提高消化效率。

• 将组织块用无钙、镁离子的PBS漂洗干净；

• 将组织置于平皿中，用眼科剪刀剪成小颗粒（1~2mm3）；

• 加入30倍组织量的蛋白酶溶液（0.1%胰蛋白酶和0.02%EDTA等比混合）；

• 移液管转至三角烧瓶，置于37℃水浴或者恒温箱中消化20~60min，每隔5~10min震荡一次。若需消化较长时间，可每隔15min将2/3的消化上清液转移到离心管中冰浴或离心去除消化液，加入含血清培养基终止消化，另补充新的消化液至三角烧瓶中继续消化；

• 将消化液或分批收集的细胞悬液经200~300目的滤网过滤，300g离心5min，弃上清；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整浓度至1x10⁷/mL备用。

5） 胶原蛋白酶消化法：

此法适用于分离纤维性组织、上皮及癌组织。钙、镁离子不会抑制消化作用，因此可用PBS或含血清培养基配制以提高细胞成活率。

• 将组织块用PBS漂洗干净；

• 将组织置于平皿中，用眼剪刀剪成小颗粒（1~2mm3）；

• 加入30倍组织量的蛋白酶溶液（0.1~0.3μg/mL的胶原蛋白酶）；

• 移液管转至三角烧瓶，置于37℃水浴或者恒温箱中消化4-48h，每隔5~10min震荡一次。亦可每隔15min将2/3的消化上清液转移到离心管中冰浴或离心去除消化液，加入含血清培养基终止消化，另补充新的消化液至三角烧瓶中继续消化；

• 将消化液或分批收集的细胞悬液经200~300目的滤网过滤，300g离心5min，弃上清；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整浓度至1x10⁷/mL备用。

注意：以上几种为最常见的实体组织样本单细胞制备方法，机械法常常造成严重的细胞损伤，单细胞产量低；酶学法、化学法（酶和EDTA结合使用）对实体组织的分散解聚较理想，但对所测细胞化学成分可能存在不良影响，所以需结合实验目的选择合适的单细胞悬液制备方法。

石蜡包埋组织样品制备

外科手术获得的实体组织，大部分经过石蜡包埋处理。石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立，扩大了流式细胞术的应用范围。

• 将石蜡包埋组织切成40~50μm厚的组织切片3~5片，或者用乳钵研成0.5mm直径大小的颗粒，放入10mL的试管中；

• 加入5~8mL二甲苯，室温下脱蜡1~2天，视石蜡脱净与否，更换1~2次二甲苯，石蜡脱净后，弃去二甲苯；

• 水化：依次加入5mL 的100%、95%、70%、50%梯度乙醇，每次10min；

• 去乙醇，加入蒸馏水3~5mL，10min后弃之；

• 消化：可加入2mL的0.5%胰蛋白酶（pH1.5~2.0）消化液，置于37℃恒温水浴中消化30min，在此期间，每隔10min用振荡器震荡1次；

• 消化30min后，加入含血清培养基终止消化；

• 经300目尼龙网过滤，未消化好的组织可进行第二次消化；

• 收集细胞悬液，300g离心5min，弃上清；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次；

• 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整浓度至1x10⁷/mL备用。

注意事项

Ø 新鲜组织标本应及时进行处理保存，以免组织在室温下放置时间过长，产生中心组织坏死或者细胞自融，影响FCM测定结果；

Ø 酶学法要注意条件的选择和影响因素，同时注意酶的溶剂、消化时间、pH值、浓度等方法对酶消化法的影响；

Ø 不同的实体组织应选取不同的制备方法，如富含细胞的组织----淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样瘤以及一些软组织肉瘤等，用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞；

Ø 在使用酶学方法时，应重视酶的选择，如含有大量结缔组织的肿瘤----食管癌、乳腺癌、皮肤癌等，应选用胶原酶消化。

仪器平台

分析型流式细胞仪（BD FACS Calibur）：只检测不再培养，细胞样本分析后进入废液桶，不能回收利用。

平台BD FACS Calibur重要仪器参数：
主机系统：含15mw 488nm氩离子蓝色激光器，635nm红色激光器，4个荧光探测器和2个散射光探测器；
滤光片：488nm激光的荧光通道包括530/30nm、585/42nm、670nm LP；635nm激光的荧光通道：661nmLP；
可选用荧光：FITC，PE，PerCP，PI，PE-Cy5，PerCP-Cy5.5，PE-Cy，APC，Rhodamine，Cyanine等。

分选型流式细胞仪（BD FACS AriaII）：检测后培养既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选。

平台BD FACS Aria II Cell Sorting System重要仪器参数：
主机系统：配置375nm、488nm、640nm三种不同波长的激光器，单细胞分选模块,可做单细胞分选，9个荧光探测器和2个散射光探测器；
可选用荧光：：可同时检测9种荧光标记细胞，DAPI、BV510、FITC、PerCP、PE、PE-CY7、PE-CF594、APC、APC-CY7。

平台拥有或能够协调BD FACS Calibur™流式细胞仪分析仪2台，BD FACS Aria II Cell Sorting System (3 Lasers)流式细胞分选仪2台，BD FACS melody流式细胞分选仪1台，BD FACS Verse流式细胞分析仪1台，Image StreamX Mark II 量化成像流式细胞分析仪1台，能够承接从动物建模（或细胞培养及建模）、抗体配色、样本前处理（如血液样品处理）、上机检测到数据分析的一站式流式检测服务。通过专业权威的实验服务、丰富全面的数据信息、标准化高质量的资源交流，覆盖生物医学领域的万千用户。

技术应用

细胞结构：细胞大小；细胞颗粒度；细胞表面积；核浆比例；DNA含量与细胞周期；蛋白质含量
细胞功能：细胞表面/胞浆/核的特异性抗原；细胞活性；细胞内外的细胞因子；激素结合位点；细胞受体；蛋白磷酸化；pH值；钙离子浓度；细胞膜电位/线粒体膜电位

服务内容

检测项目	检测试剂/试剂盒
1.流式细胞术FACS-分子Marker标记及分析
PBMC分选特定亚型细胞/单细胞	标记特定通道流式抗体CD分子Marker
细胞表面抗原	T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞等、Macrophage M1/M2等
细胞胞内抗原	Th1/Th2/Th17检测或者其他特定细胞的细胞因子检测（白细胞介素ILs（IL2、IL6、IL12、IL17等，TNFα、IL1-β、IFNs（干扰素家族因子α,β,γ））
细胞核内抗原	调节性T细胞（treq）
淋巴细胞免疫分型	淋巴细胞亚群分析（T/B/NK ）、辅助性T细胞、抑制性T细胞、调节性T细胞（treq）、T淋巴细胞活化检测，细胞表面标记物检测，Th1/Th2/Th17等
T细胞亚群	CD3+，CD4+，CD8+细胞
辅助性T细胞亚群	主要包括Th1/Th2/Th17
巨噬细胞分型	M1/M2
核内因子检测	Treg、Tfh、Tfr
血小板相关抗体分析	CD62等
干细胞鉴定/检测	ABCG2、Oct-4、 SSEAs、 CD34、CD133、Sca-1、 c-kit等
原代细胞鉴定	细胞表面或胞内Marker
PNH相关抗原检测	CD55/CD59
MDSCs分型检测	小鼠：CD11B+Gr1-,两个亚型：粒细胞样：CD11B+Ly6C-Ly6G+；单核细胞样：CD11B+Ly6C+Ly6G-；
MDSCs分型检测	人源：CD11B+CD14-CD33+
单核细胞检测
DC细胞检测
粒细胞检测
原代细胞体外诱导分化	原代细胞及其诱导细胞表面标记物流式检测
单细胞带荧光的目的细胞分选	细胞磁珠分选/FCS流式分选
2.流式细胞术FACS-功能表型检测
细胞凋亡检测	Annexin V-FITC/PI、Annexin V PE/7-AAD、Annexin V-APC/PI、Heochst 33342/PI等
细胞周期检测	流式分析G0/G1期、S期、G2期和M期
细胞增殖检测	CFSE、BrDU、 EDU
细胞活性检测	钙黄绿素 AM
线粒体膜电位	JC-1、JC-10、TMRE
活性氧检测	ROS等2′,7′-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)捕获剂
细胞毒性检测	DRAQ7™ 和 7-AAD、碘化丙啶、胺反应性染料
可溶性蛋白质分子	血清/细胞上清中的Th细胞因子、炎性因子和抗病毒因子
钙流检测	Fluo-3/4等
流式多种细胞因子	CBA检测
液相多因子检测	Luminex液相芯片细胞因子检测
常见组织单细胞悬液制备	PBMC (人、小鼠、大鼠等)分离制备；脾脏、肝脏、淋巴结、骨髓、肿瘤(小鼠、大鼠等)

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流式流式细胞术流式分选流式分析单细胞分选

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