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还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒
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  • 2022-08-15 14:44:09

上海朗顿生物科技有限公司

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1.原理

在一定浓度的混浊菌液中,由于溶菌酶能水解细菌细胞壁上肽聚糖使细菌裂解而浓度降低,透光度增强,故可以根据透光度变化来推测溶菌酶的含量。

2.测定意义

谷胱甘肽(GSH)是一种低分子清除剂,它可清除O2-、H2O2、LOOH。谷胱甘肽是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种三肽,是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物,并且是GSH—PX和GST两种酶类的底物,为这二种酶分解氢过氧化物所必需,它并且能稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其它辅因子受氧化损伤,***近还证明GSH也参与使维生素E恢复到还原态的作用,缺乏或耗竭GSH会促使许多化学物质或环境因素产生中毒作用或加重其中毒作用,这可能与增加氧化损伤有关,因而GSH的量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。

3.测试所需仪器设备及自备试剂

酶标仪(530nm),恒温水浴锅,离心机, 漩涡混匀器,精密移液器。

4.试剂及配置

试剂

30T

试剂1

菌粉,5mg*4支

试剂2

菌粉溶液,100ml*1瓶

标准品

标准品,2mg*1支,活力为80000U/mg

(1)贮备菌液的配制:取 5mg/支的菌粉 1 支,倒入匀浆管中,加菌粉溶剂 1ml,轻轻缓慢上下旋转研磨3 分钟(切勿溅出),即为贮备菌液,将其取出后置 2~8℃冰箱密封保存一周左右。

(2)应用菌液的配制:按贮备菌液:菌粉溶剂=1:19 进行配制,需多少配多少。剩下的应用菌液 2~8℃可保存一周左右。是现用现配,用时摇匀。

(3)标准品的配制:

①、标准品贮备液的配制:每支准确加双蒸水 1.0ml 配成 2mg/ml 的标准品贮备液。2~8℃可保存 7~10 天。

②标准品应用液的配制: 临用时按标准品贮备液∶双蒸水=1∶799 比例稀释成 2.5µg/ml(即 200U/ml)的标准品应用液,需多少配多少。2~8℃保存,可保存 7~10 天。 

5.样本处理

(1)血清(浆):直接加样。

(2)组织匀浆液的制备:准确称取组织重量,按重量(g):体积(ml)=1:9的比例加入9倍体积的生理盐水,冰水浴条件下,制备成10%的组织匀浆,10000转/分冷冻离心30分钟,取上清,再用生理盐水稀释成***取样浓度。

6.操作步骤

(1)自身对照法测定溶菌酶 

(适用于样本数量较少,或者样本有混浊或有颜色,如血液红色) 

[注]:本法用分光光度计 530nm 处,1cm 光径比色皿测得是样本或标准的透光度值 

①、将配制好的应用菌液,标准应用液及所需检测的样本均放入 37℃水浴箱中预温 5 分钟 

以上。使菌液,标准液及检测样本的温度达到 37℃。 

②、将可见分光光度计于 530nm 处,1cm 光径比色皿,以双蒸水调透光度 100% (比色皿准备两

只,一只用于调透光度 100%,一只用于测定)。 

③、往相应编号的试管中加入 0.2ml 待测样本,取 2ml 应用菌液迅速冲入试管中,立即混

匀并计时。(标准品应用液取 0.2ml 双蒸水,加入 2ml 应用菌液,其它操作与测定相同) 。

④、迅速倒入比色皿中在可见分光光度计 530nm处比浊,5 秒时读取透光度值T0, 比色皿不

要取出,在 2 分 5 秒时读取透光度值T2。

[注]:如 5 秒时来不及读数,可 20 秒时读取调透光度值T0,在 2 分 20 秒时读取透光度值T2,标准管需同样操作。 

⑤、求出 2 次透光度的差值(△T= T2-T0)。

[注]:用同一比色皿每检测一个样本后均要用双蒸水冲洗干净,才可再放第二个样本或标准品应用液。

(2)空白对照法(适合澄清,不带颜色的样本)

 

空白管

标准管

测定管

双蒸水(ml)

0.2

   

标准品应用液(ml)

 

0.2

 

样本 (ml)

   

0.2

应用菌液(ml)

2

2

2

37℃准确水浴 15 分钟,立即取出置于 0℃以下的冰水浴中 3 分钟,逐管取出,倒入 1cm光径比色皿中,530nm处,双蒸水调透光度 100%,比色,测各管透光度T15(T15即 37℃水浴 15分钟后的透光度值)。

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