一、CO-IP实验原理是什么？

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

细胞裂解后，孵育结合了抗体的珠子，诱饵蛋白通过其抗体结合到Beads上，同时诱饵蛋白的互作蛋白，也一起“共沉淀”到Beads上。洗涤掉未结合的蛋白后，再用洗脱液将互作蛋白复合物从Beads洗脱下来，便得到免疫共沉淀产物，产物既可用Western Blot检测已知蛋白，也可用质谱鉴定未知蛋白。

• 免疫共沉淀有哪些常见问题呢？如何解决？

• 免疫共沉淀实验结果出现假阳性是为什么，怎么解决？

答：出现假阳性可能的原因及解决办法如下：

• 推荐使用特异性更强的抗体，并且适当稀释抗体浓度。
• 可能是细胞裂解液中含有太多的细胞和蛋白，导致洗脱液中有很多额外的蛋白质（假阳性）。这种情况下建议使用10~50μg细胞裂解液即可。
• 洗涤不充分。这种情况下建议盖上管盖离心前颠倒几次。

• 同一批次提取的蛋白，胶跑出的条带都不一致，这是什么原因呢？

答：可能涉及几个原因：（1）拔梳子时胶错动，加入样本后渗入其他孔或漏出。因为内参表达高，可能不会显示出差异。（2）加入样本时不均匀也可能会产生误差。（3）制胶应保证均匀无气泡，玻璃板干净，这样才能保证结果一致可靠。

• 请问IP和IB是什么呢？

答：IP是加入抗体后的所吸附的蛋白的实验结果与input是对照，IB就是对IP后的蛋白进行WB实验所得到的图片。

• 样品中的蛋白被蛋白酶降解怎么办？

答：样品中的蛋白被蛋白酶降解，这种时候建议操作过程中添加蛋白酶抑制剂，有条件的话，全程在4℃环境下操作，可缓解样品中蛋白降解的情况。

• 实验结果背景高，有哪些原因，该如何解决？

答：（1）非特异性蛋白与珠子结合，这是因为珠子用BSA预封闭不充分。应该确保牛血清白蛋白（组分V）新鲜，新鲜珠子与含1%牛血清白蛋白的PBS孵育1小时，使用前PBS洗3-4次。

• 使用太多抗体导致背景高。最佳的抗体浓度才可能得出好的结果，那么在实验进行前，除了要保证抗体的特异性之外，最好进行一个抗体浓度梯度的摸索。

• 在免疫共沉淀实验中没有检测到目的蛋白，有哪些原因，该如何解决？

答：（1）样品中目的蛋白未表达或者表达量低。这种 情况下建议确定目的蛋白的蛋白谱，确定它会表达。

（2）可以适当增加裂解液，但要注意后续要将裂解液去除干净。

（3）抗体使用量少，没有足够的抗体去捕获目的蛋白。建议增加抗体的使用量。

（4）缓冲液、洗脱液的pH可能不能将目的蛋白洗脱。建议根据想要洗脱的蛋白质，调整溶液正确的二pH值。

（5）抗体没有与免疫吸附物结合。注意查看该吸附物与抗体亚型是否匹配。

• 在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意什么呢？

答：（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。

（2）要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。

（3）确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。

（4）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或Triton X-100）。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2% SDS），细胞裂解液中要加各种酶抑制剂。

（5）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。

（6）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗。

兔多克隆抗体：正常兔IgG。

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