无血清培养基的发展、优化和应用

　　随着生物医药产业和生命科学基础研究对动物细胞培养规模、效率和安全性能要求的不断扩大和提高，无血清培养基的研制和开发已经成为细胞工程领域的重要课题。动物细胞培养基的发展已有60多年的历史，其中经典培养基（ClassicalMedia，CM）主要是指20世纪五六十年代一些公开配方的传统培养基，如MEM、M199、DMEM、RPMI1640、DMEM/F12等，此类培养基需要配合10%左右的牛血清才能使用。由于牛血清成分复杂、批次间差异较大，培养过程中有外源物污染的风险，因此科学家们一直致力于研究牛血清替代物，研发无血清培养基。

　　无血清培养基的发展历经了无血清来源、无动物源、无蛋白和化学成分限定培养基等4个阶段，逐步使得无血清培养基的成分更为明确和简单，进一步提升了无血清培养基在细胞培养中可避免外源物污染等优势，使其在生物制品和生命科学领域获得了广泛的应用和发展。

　　1.1无血清培养基（Serum-FreeMedium，SFM）

　　无血清培养基，即不添加动物血清。为满足细胞的生长，此类培养基会添加替代血清功能的成分，如大量动植物来源的蛋白，这使得添加物质的化学成分不够明确，会对后续处理造成不利影响。

　　1.2无动物源培养基（AnimalComponentFreeMedium，ACFM）

　　为满足细胞生长及增殖的需要，此类培养基采用蛋白水解物、重组蛋白或其他化学物质替代动物源蛋白，以避免动物来源的风险，降低生产成本，但该类培养基的产量较低。

　　1.3无蛋白培养基（Protein-FreeMedium，PFM）

　　无蛋白培养基是指完全不含有血清和动物源的蛋白，但仍包括来源于植物蛋白的水解物，如大豆水解物或含有合成多肽等其他衍生物。该类培养基的蛋白质含量极低，水解物不稳定，虽然化学成分明确，有利于重组蛋白的下游分离和纯化，但通用性较差，需要针对目标细胞株进行特异性的优化。

　　1.4

　　化学成分限定培养基（ChemicallyDefinedMedium，CDM）

　　化学成分限定培养基是指完全无血清、无动物蛋白，也不含植物水解物，是一类化学成分明确的培养基。这种培养基批次间差异小，提高了生产工艺的重复性，并有效降低了纯化成本。因为化学成分明确，有利于进行细胞培养的代谢及调控研究，是工业生产抗体和重组蛋白的主流培养基，也是无血清细胞培养基。

　　2.无血清培养基优化

　　2.1

　　优化策略

　　通常，为了更好地优化无血清培养基的组分，研究人员采用培养过程分析法、分子生物技术法和统计学设计法。培养过程分析法是指通过检测细胞培养过程中所需的营养物质及代谢副产物的浓度变化，研究细胞的代谢活动；分子生物技术法可在分子水平上观察细胞在培养过程中的变化，有助于准确预测细胞的生长和代谢状态；统计学方法是运用统计学工具优化培养基，并对结果进行分析，尽可能减少试验次数分析多种因素。

　　2.2

　　培养基开发和优化中的实验设计（DesignofExperiment，DOE）

　　实验设计（DOE）是一种计划实验和分析所获得信息的数理统计方法，它的优势在于一次评估多个组分及其相互作用，减少不必要的实验规模和数量，并允许观察培养基组分之间复杂的相互作用。

　　在细胞培养基优化过程中，实验设计分为3个步骤。

　　①筛选，基于现有商业培养基进行筛选，以确定重要组分的群组以及初步优化，如使用简单的、以实验为依据的单次单因子（OneFactorataTimeStrategy，OFAT）方法解决复杂的优化。

　　②优化，基于DOE对已确定的重要组分进行进一步优化，主要优化基础培养基、补料培养基、一些添加物等，如使用响应曲面法（ResponseSurfaceMethodology，RSM）找出多变量体系中的*优条件。

　　③验证，对最终的培养基进行放大验证，分别用优化好的培养基与现用的或商业无血清的培养基培养细胞，比较各自的生长指标与抗体表达水平。

　　培养基开发的基本方法

　　筛选阶段也可基于Plackett-Burman设计，从大量因素中筛选出若干个的影响因子。优化阶段使用响应面分析法，常用方法有(图1a)CentralComposite和(图1b)Box-Behnken等来确定重要影响因子。

　　3无血清培养基的应用

　　大部分生物制药是利用动物细胞生产的，动物细胞培养技术是生物制药生产工艺的核心技术，而细胞培养基是细胞培养的基础，是生物制药生产的关键原材料之一。目前细胞培养基广泛应用于重组蛋白、单克隆抗体、疫苗和基因治疗药物的表达载体等生物制品的生产。

　　3.1在单抗和重组蛋白细胞培养平台的应用

　　目前CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）已经成为需要复杂翻译后修饰的治疗性蛋白及单抗药物生产的宿主细胞，70%以上的动物细胞表达药物产品都是以CHO细胞表达的。在单抗药物中使用的细胞培养基基本上是化学成分限定培养基（ChemicallyDefinedMedium）和补料（Feed）。例如，HyCloneActiPro和补料7a/7b是针对表达重组蛋白和抗体的CHO细胞培养基，它是根据细胞代谢途径分析方法设计的化学成分限定，不含动物源成分的商业化培养基。使用ActiPro培养基适当搭配CellBoost7a/7b补料培养基可明显提高产量，ActiPro系列适用于多种CHO细胞系列，如CHO-K1、CHO-DG44和CHO-S。

　　3.2在病毒疫苗细胞培养平台的应用

　　自2020年以来，病毒肺炎在世界范围内爆发和流行，严重威胁了人类的生命健康，而病毒疫苗的研发和使用是应对病毒传播和流行的重要手段。传统疫苗领域使用经典培养基添加牛血清生产疫苗，血清成分复杂性和外源污染带来的潜在风险，而无血清培养基可以解决病毒疫苗中的血清问题。在病毒疫苗规模化培养中，无血清培养的关键是设计符合细胞贴壁特性和高细胞密度的无血清培养基。疫苗生产使用的无血清培养基HyCloneVaccineXpress适用于贴壁细胞依赖性细胞系（Vero细胞）的高密度生长和维持，目前已广泛应用于生产，如流感（Influenza）、寨卡（Zika）、脊灰（Polio）、登革热（Dengue）和呼吸道合胞体病毒（RespiratorySyncytialVirus，RSV）等多种病毒类疫苗。

　　3.3在细胞/基因治疗所用病毒载体的生产平台的应用

　　人胚肾细胞系HEK293广泛用于治疗生物制品的生产，如用于基因治疗的病毒载体、溶瘤细胞药物、病毒样颗粒疫苗、病毒载体疫苗等，通常采用化学限定的的无血清培养基。

　　3.4在细胞疗法中的应用

　　干细胞（StemCells，SC）是一类具有自我修复能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞治疗倾向于采用无血清培养基，也有一些用于研究的干细胞培养采用加血清的α-MEM完全培养基。在肿瘤治疗方面，基于树突状细胞（DendriticCells，DC）的肿瘤疫苗被认为是治疗恶性肿瘤的一种有效途径。使用无血清培养可以彻底解决DC肿瘤疫苗治疗中血清干扰的问题。在免疫细胞治疗方面，CAR-T、CAR-NK通常也采用无血清培养基培养。