概述

凝血酶为一种丝氨酸蛋白水解酶，可以选择性水解纤维蛋白原的Arg-Gly肽键，生成纤维蛋白，释放纤维蛋白肽A和B[1.2]。    

在生物体内凝血酶主要以凝血酶原（Factor Ⅱ）的形式存在，凝血酶原主要在肝脏生成。凝血酶原被X因子(Factor X)水解激活，释放有活性的多肽，并且将凝血酶水解成轻、重两条链，生成有催化活性的α型凝血酶。α型凝血酶由一条轻链（A链，分子量约为约为6 kDa）和一条重链（B链，分子量约为31 kDa）组成。A、B两条链通过一个二硫键相连[4]。人凝血酶B链由两部分组成，一个为多肽（分子量为29485Da），另一个为多糖部分（分子量为2334Da），两者在三个天冬氨酸残基位置通过N-连接糖基化[5,6]。

凝血酶也含有γ-羧基谷氨酸残基。这种修饰后的谷氨酰基残基是微粒体酶羧化作用的结果，是依赖于维生素K的羧化酶。γ-羧基谷氨酸残基是Ca2+依赖型与带负电荷的磷脂表面相互作用将凝血酶原转化为凝血酶的关键[4]。凝血酶在磷脂膜表面被激活，将凝血酶原的氨基端与Va因子（Factor Va）和Xa因子(Factor Xa)结合在一起。由于V因子最先被激活成Va因子，因此激活过程缓慢，只产生少量的凝血酶。凝血酶不需要二价的金属离子或共同作用因子来激活。但凝血酶需要Na+进行变构激活，在特异性切割精氨酸残基中发挥着重要作用[10]。血栓调节蛋白是凝血酶激活蛋白C过程中的共同作用因子[11]。

凝血酶水解纤维蛋白原只发生在Arg残基。其酶切位点不是特定的，酶切结果产生两种产物：最主要的水解产物为纤维蛋白肽A。来源于任何一种哺乳动物的凝血酶均可凝固来源于另外一种哺乳动物的纤维蛋白原[8]。纤维蛋白肽A是在纤维蛋白原第16个或第19个氨基酸位置发生水解产生的；而另外一种水解产物纤维蛋白肽B是在第14个氨基酸位置发生水解而产生[9]。凝血酶也能催化水解一些多肽的ρ-硝基苯胺、对甲苯磺酰基-精氨酸苄酯以及硫代苯酯合成的合成底物[13]。

在一定贮存条件下，凝血酶会自我催化水解生成β型凝血酶和γ 型凝血酶。β、γ 型凝血酶对纤维蛋白原无水解活性，但是保留了除纤维蛋白原以外的合成肽底物和蛋白底物活性[12]。该凝血酶制剂主要为α 型凝血酶。

 

凝血酶最适酶切位点[2]

1、A-B-Pro-Arg-||-X-Y 其中，A和B为疏水氨基酸，X和Y为非酸性氨基酸

2、Gly-Arg-||-Gly

 

催化pH范围：5-10

 

分子量：39 KDa[16]

 

活性检测

使用中国生物制品检定所的凝血酶和纤维蛋白原标准品，以0.9ml含有0.1%凝固物的纤维蛋白原溶液为底物，在37℃水浴中与0.1ml不同效价凝血酶溶液反应，观察初凝时间，反应初凝时间在14-60秒为宜。以标准品效价（单位）的对数为横坐标，初凝时间（秒）为纵坐标，进行直线回归，求得样品凝血酶效价。

 

配制说明

凝血酶产品是由含NaCl和甘氨酸, pH6.8的凝血酶溶液冻干而成。使用时用0.9% NaCL溶液配制成10mg/mL的凝血酶溶液。

 

储存/稳定性

储存溶液可以制备成含100unit/mL凝血酶的0.1%(w/v)BSA溶液。储存溶液在0-5℃环境下可保留酶活力一周。溶液在pH 6.5最稳定，当pH>7时，将显著降低凝血酶活性。由于玻璃瓶对凝血酶吸附作用，因此推荐将凝血酶溶液分装在塑料容器中，-20℃可保存三年以上.