Taq SYBR® Green qPCR Premix (通用型) 

 

产品货号：R0202

储存条件：长期保存请于 -20℃避光保存，Mix 融解后可在 4℃避光条件下稳定存放一个月，尽量避免反复冻融。

 

产品简介

Taq SYBR® Green qPCR Premix 是 SYBR® Green I 嵌合染料法专用qPCR试剂，为2×预混液，包含除引物和DNA样品以外的所有qPCR组分，可减少操作步骤，缩短加样时间，降低污染几率。其核心组分是经抗体修饰的热启动Taq DNA聚合酶，配合精心优化的Buffer体系以及PCR反应促进因子，使产品具有特异性强、扩增效率高等特点，有效抑制非特异性扩增，可对宽广浓度范围的模板进行准确定量，获得稳定可靠的qPCR结果。

 

使用方法

1.适配机型

全机型通用

2.使用注意

① 因Mix中预混有染料，其保存或反应体系配制过程应避免强光照射；

② 使用前上下颠倒轻轻混匀Mix，请勿涡旋振荡混匀，避免产生过多气泡。

3.建议的qPCR反应体系

试剂	使用量	终浓度
Taq SYBR® Green qPCR Premix	10ul	1×
正向引物 (10uM)a	0.4ul	0.2uM
反向引物(10uM)a	0.4ul	0.2uM
DNA模板b	X ul	10~200 ng/20ul
Nuclease-Free Water	To 20ul

 

a.调通推荐的引物终浓度为0.2uM，反应效果不佳时可在0.1~1uM范围内进行调整;

b.推过荐模板加样量的为1~2ul，如模板类型为未稀释cDNA原液，模板添加量不应超过总反应体系的10%，不同种类DNA模板中含有的靶基因拷贝数目不同，必要时可进行梯度稀释，以确定必要的DNA模板添加量。

4.qPCR 反应程序（可根据机型适当调整）

两步法：

40 cycles

步骤	温度	时间
预变性	95℃	30 sec
变性	95℃	10 sec
退火&延伸a	60℃	30 sec
熔解曲线b	使用仪器默认采集程序

 

三步法：

40 cycles

步骤	温度	时间
预变性	95℃	30 sec
变性	95℃	10 sec
退火a	55 ~ 65℃	10 sec
延伸a	72℃	30 sec
熔解曲线b	使用仪器默认采集程序

a.根据引物的Tm值进行退火&延伸（退火）温度的设定；若扩增片段在200bp以内，退火&延伸（延伸）时间可以设置为15sec;此外，退火&延伸（延伸）时间的设置还需根据您使用的qPCR仪所需的最短数据采集时间自行调整；

b.不同 qPCR 仪的熔解曲线采集程序有差别，一般可使用仪器默认的熔解曲线采集程序。

 

5.实验优化

若使用默认反应条件反应性能不佳时，则需要进行反应条件的优化，可以从引物浓度以及扩增程序两个方面进行：

① 引物浓度调整

当引物终浓度在0.1~1.0uM范围之间变化时，引物浓度越低，扩增特异性越高，但扩增效率会有所下降。

② 扩增程序优化

需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。

 

6.引物设计原则

① 扩增产物长度建议控制在80~200bp；

② 引物长度为18~25bp；

③ 正向引物和反向引物的Tm值相差不超过 1℃为佳，Tm值控制在58~62℃为佳；

④ 引物的GC含量控制在 40%~60% 之间；

⑤ 引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避开T/C或者A/G的连续结构（特别是3'端）；

⑥ 引物3'端最后一个碱基最好为G或者C；

⑦ 避开引物内部或者两条引物之间的互补序列；

⑧ 使用NCBI BLAST功能检索确认引物的特异性。

 

问题描述	可能原因	解决办法
扩增曲线不光滑	荧光信号太弱，经系统校正后产生	确保Mix中预混的染料未降解；更换荧光信号收集更好的qPCR专用耗材
扩增曲线断裂或下滑	模板浓度较高，基线的终点值大于Cq 值	减小基线终点(Cq-4)，重新分析数据
个别孔扩增曲线突然骤降	反应管内留有气泡	确保Mix完全溶解，请勿涡旋振荡混匀 加样完成后轻弹离心去除气泡 延长预变性时间至10min，以去除气泡
反应结束无扩增曲线出现	反应循环数偏少	设置循环数为40，但更多的循环数会增加过多的背景信号
	荧光信号采集步骤未设置或者设置错误	两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火&延伸阶段，三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段
	引物可能降解	长期未用的引物，应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能
	模板浓度过低	减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起
	模板降解	重新制备模板，重复实验
Cq 值出现过晚	扩增效率低	提高引物浓度，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物
	模板浓度过低	减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起
	模板降解	重新制备模板，重复实验
	扩增产物过长	扩增产物长度控制在80~200 bp
	体系中存在 PCR 抑制剂	一般为模板带入，加大模板稀释倍数或重新制备纯度高的模板重复实验
空白对照出现信号	反应体系污染	首先更换空白对照的水，如果还发生同样情况，继续更换引物、吸头、PCR 管或启用新的Mix；反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染
	出现引物二聚体等非特异性扩增	一分般析在 35 循环以后空白对照出现扩增产物属正常情况，应配合熔解曲线进行重新设计引物，调整引物浓度或优化PCR反应程序
熔解曲线出现多峰	引物设计不佳	根据引物设计原则重新设计新引物
	引物浓度过高	适当降低引物浓度
	cDNA 模板存在基因组污染	提取后的RNA溶液使用DNA酶进行消化，例如：dsDNase，以去除基因组污染，或设计跨内含子引物
实验重复性差	加样误差大	使用精准的移液器、配合高品质吸头准确移液 高倍稀释模板，加入大体积模板减少加样误差 放大qPCR反应体积
	模板浓度过低	减少模板稀释倍数重复实验
	qPCR仪不同位置的温度偏差	定期校准qPCR仪