全基因敲除
- RY6
- 上海睿远生物
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- 2022-05-05 17:09:28
上海睿远生物医药科技有限公司
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技术简介
根据基因的结构特征，选择整个基因，基因组序列作为敲除区域，在基因的5'和3’UTR区域设计相应的sgRNA，同时构建含与敲除基因5'和3’临近区域同源的Donor质粒，将Cas9，两条对应的sgRNA和Donor共转染目的细胞，通过sgRNA引导Cas9核酸酶对目的基因靶位点进行切割，引起DNA双链断裂(Double-strand breaks，DSB),通过细胞自身的同源重组修复（Homology-directed repair，HDR)途径，将Donor质粒重组到目的细胞的基因组中，造成目的基因在基因组序列上的完全敲除，达到基因的完全敲除的效果
应用范围
| 1 | 2 | 3 |
| 基因敲除更彻底，用于基因功能研究，抗体验证等实验时更有说服力 | 适用于存在多个转录本的编码基因的敲除 | 适用于非编码基因的敲除 |
方案选择
| 1 | 2 | 3 |
| 拥有质粒瞬转和慢病毒感染两种递送方式，可实现大多数细胞系和干细胞的基因编辑 | 拥有多种荧光筛选标记，结合流式分选，可提高获得阳性目的细胞的概率 | 在细胞不产生耐药的情况下，可提供多种药筛标签，满足不同实验需求。 |
应用案例
细胞名称：Thp-1
基因名称：MIR3945HG
项目方案：构建Cas9/sgRNA过表达质粒和含Donor片段的过表达质粒，转染Thp-1细胞，再通过流式分选对GFP和mCherry阳性的细胞进行筛选，挑单克隆经鉴定后进行扩增，得到MIR3945HG全基因敲除的单克隆细胞株。
阳性细胞鉴定：通过对流式分筛选出的单克隆细胞进行PCR及测序鉴定，MIR3945HG基因整个转录本缺失，MIR3945HG基因在功能上到达完全敲除的效果。
项目流程与周期
交付标准
| 1 | 2 | 3 |
| 按指定方案构建的目的基因编辑细胞株，每个目的细胞株交付基因型正确的2个克隆，每个克隆2支冻存细胞（1×10⑹cells/支） | 对照细胞株，瞬转方案为对应野生型细胞，慢病毒方案为Cas9稳转细胞 | 项目报告及质检报告 |
