非洲猪瘟及检测方法介绍

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家猪或野猪引起的一种急性、热性、高度传染性疾病。ASF原发于非洲，蜱（软蜱科中的钝缘蜱属Ornithodors）是其自然宿主和传播媒介，该病病程短、死亡率高，世界卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。

2018年8月2日，我国出现第一例关于非洲猪瘟的报道，此后席卷大江南北。仅仅过了半年，国内就有24个省份发生过家猪和野猪非瘟疫情，累计扑杀生猪91.6万头。

ASFV 是非洲猪瘟相关病毒科（Asfarviridae）非洲猪瘟病毒属的唯一成员，也是唯一的虫媒传播DNA 病毒。ASFV可在钝缘蜱体内复制并存在几个月到几年，感染蜱再叮咬猪时就会传播该病毒。钝缘蜱是ASF病毒在疫源地传播、长期保存甚至发生变异的关键因素，也是ASF在很多地区和国家久控不绝的重要原因。此外， 鼠类、蝇类、蚊类在猪场的活跃活动，让其可成为ASFV的重要机械性传播媒介。

ASFV具有独特而复杂的五层结构，从外到内分别是外膜（Outer membrane）、衣壳（Capsid）、内膜（Inner membrane）、核壳（Core shell）以及核心（Nucleoid）。

从整体上看，非洲猪瘟病毒衣壳结构跟其他核质大DNA病毒（nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDVs）衣壳结构较为相似，由20个三重对称壳粒聚集体（Trisymmetron）和12个五重对称壳粒聚集体（Pentasymmetron）组成。其中，每个Trisymmetron由135个壳粒（Capsomer）组成，而每个Pentasymmetron由30个壳粒和1个五邻体（Penton）组成。其基因组为双链闭合线性DNA 分子，基因组大小为170~ 194 kb，含有150~ 167 个开放阅读框（open reading frames，ORF），编码54 种结构蛋白和100 多种非结构蛋白。

病毒传播

ASFV 通过内吞或者胞饮作用侵染宿主细胞，其靶细胞主要是单核-巨噬细胞。巨胞饮泡或内吞体中在低pH的环境下，病毒颗粒脱去病毒囊膜，病毒内膜与内体膜融合，暴露病毒基因组。病毒DNA复制与病毒颗粒的组装发生在称为“病毒工厂”-靠近细胞核的特殊胞质区。随后病毒在细胞内组装成成熟的二十面体成熟的病毒颗粒，并通过中进行复制、转录和翻译。基因组和蛋白质组装完成后通过动力蛋白运输到细胞膜附近，经出芽释放到细胞外。

疫苗研发
迄今为止疫苗研发进展缓慢，ASFV的复杂性是疫苗研制延迟的一个主要因素。灭活疫苗迄今尚未成功，可能是因为病毒颗粒有两种感染形式，即细胞外和细胞内成熟，而中和抗体不能完全抑制这些不同病毒的感染。病毒蛋白p72、p54和p30是已知的中和抗体靶点。

减毒活疫苗可诱导高达100%的免疫保护，但是其安全性是个问题，此类疫苗上市仍需要数年时间。基于单个或多个基因或蛋白的接种的ASF亚单位疫苗可能比减毒活疫苗更安全。重组蛋白p72、p54和p30的组合疫苗，在不同研究中的作用并不一致。

抗病毒药
ASFV具有许多复制所需的特异性酶类，包括RNA和DNA聚合酶，这些酶应该是抗病毒药物开发的良好特异靶点。有几种化合物已被证明在细胞培养中抑制了ASFV的复制，但到目前为止还没有在猪身上进行过试验，目前暂无上市药物。

因为缺乏疫苗以及特效药，目前控制ASF必须依赖于检疫和屠宰政策以及快速检测。这也是国家和各省市接连出台相关防控政策的重要原因。

根据国家市场监督管理总局发布最新版《非洲猪瘟诊断技术》（GB/T 18648-2020），目前该病毒检测主要分为核酸检测，抗原检测，抗体检测三大类。

核酸检测
ASFV核酸检测常用普通PCR法，qPCR（荧光定量PCR）, 荧光RPA，LAMP等方法。

目前，qPCR检测是该病毒检测的“金标准”，其灵敏度及特异性好，可避免污染假阳性。PCR及qPCR法大多基于非洲猪瘟B646L基因的高度保守区设计。也有根据E183L基因、CP530R 基因、CSFV 5'UTR 基因和HP-PRRSV NSP2 基因设计引物和探针。qPCR法检测的灵敏度可比普通PCR法高10~1000倍，已广泛应于ASFV的检测，可以在1h内完成检测。也有部分试剂盒不用核酸提取，直接扩增，但对样品类型要求较高，敏感性也受影响。目前由包括兰州兽医研究所等多家单位共同起草、由中国兽医协会发布的T/CVMA5-2018非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法在我国非洲猪瘟病毒检测中发挥重要作用。

qPCR方法受仪器限制，需要专业的qPCR实验室。等温扩增法LAMP为基层等条件较为落后的实验室提供了一种选择。LAMP利用Bst酶，可在恒温水浴锅的高效，并可肉眼观测结果。LAMP优势是快速、灵敏，可以在30min内完成检测，操作简单，并且不需要特殊的仪器设备，该方法更适合用于田间的快速检测，在基层如屠宰场、养殖场更具有广阔的应用前景。

LAMP方法容易出现交叉污染，出现假阳性。RPA等温扩增技术使用Cre重组酶、单链DNA 结合蛋白（SSB）和Bst酶，30min内可使目的基因得到指数级增长，采用荧光探针标记，使用荧光信号检测仪，可实现对扩增的实时监控。RPA具有较高的灵敏度和特异性，快速，操作简单的优点。

根据中国国家兽药基础数据库数据显示，目前国内只有9家企业10个产品获得非洲猪瘟病毒核酸检测试剂的生产批准文号。

抗原检测
非洲猪瘟病毒抗原检测目前最常用的方法是夹心ELISA抗原检测。ASFV的P30蛋白由CP204L基因编码，具有很强的免疫原性，可诱导机体产生中和抗体，为病毒的早期蛋白，在感染后4h胞浆内即可检测到。GB/T 18648-2020中详细描述了采用P30蛋白单克隆抗体检测相应的抗原。虽然该方法灵敏度低于“金标准“，存在假阴性的缺陷，但是因为其成本比PCR更为低廉且可在没有特殊实验室仪器的设备下操作，可作为急性病例或者大规模的样本筛查辅助方法。

胶体金免疫层析法，操作简单、快速，可以10min内完成检测，不需要仪器读数。但该方法的灵敏度较差，可能会存在假阴性结果。由于其局限性，当前仅适用于病死猪的ASFV检测。有研究以检测P72蛋白建立胶体金法。

同样基于侧向层析的荧光免疫技术，灵敏度比胶体金提高了约100倍，操作比ELISA更简便。该方法内含有大量荧光报告分子，荧光信号强而稳定，不受溶剂的影响，具有极强的抗光漂白能力，采用手持式荧光仪读取数值，人为因素影响小。

抗体检测
ASFV抗体在感染早期（7-10天）就可被检测到，并且会存在数年甚至终生。而ASFV抗体阳性，是机体感染该病毒的最直接证据。GB/T 18648-2020中详细的介绍了ELISA间接、阻断（竞争）、夹心等方法的步骤及结果判读。该方法适用于亚急性、慢性、及大规模血清筛查，但不适用于急性病例（检测到抗体时机体已经死亡）。目前，用于抗体检测的抗原主要是包括P30、P54、P72等蛋白。如INGENASA基于P72特异性抗体的阻断ELISA检测试剂盒，SVANOVIR 基于P30蛋白的间接ELISA检测试剂盒等。

参考文献：

Sheng Liu, et al. Cryo-EM Structure of the African Swine Fever Virus [J]. Cell Host&Microbo，26, 836–843

《中华人民共和国国家标准GB/T 18648-2020》岳龙等. 非洲猪瘟概况综述[J]. 养殖与饲料, 2020 年第05 期