如何处理实时荧光定量PCR数据

实时荧光定量PCR数据中的基本概念：

在整个扩增过程中会出现基线期，指数期，线性期和平台期。其中在基线期和指数增长期，扩增产物都是以指数级增长，但是在基线期我们没办法检测；而到了线性期和平台期之后，由于不同基因，或者不同条件下其扩增效率差别很大，因此没有办法计算模板的含量。因此，在指数增长期的CT值就成了计算模板含量的关键值。

▲ 图一：线性图谱

▲ 图二：对数图谱

为什么知道CT值就能够得到最初的目标基因含量呢？

如图三，表示一个基因单次扩增曲线。N为扩增产物的分子数，模板的分子数乘以1+扩增效率的n次方，n代表循环次数。也就是说，如果扩增效率为100%，产物的分子数就等于模板数乘以2的n次方。但是在线性增长期和平台期，扩增效率不可能是100%，因此PCR理论方程只在指数期成立，也就是图三绿色框的部分。

▲ 图三

数据处理：

以下三张图分别表示我们在做荧光定量PCR时提到的三个名称：扩增曲线、标准曲线、溶解曲线。

1、绝对定量：使用一系列稀释的已知浓度的标准品与未知样本同时进行测定，根据系列浓度标准品的CT值与起始模板量之间的线性比例关系。

注意事项：

☑  标准品必须来源可靠，浓度已知。

☑  标准品要和待测样品同时在仪器中扩增。

☑  只能根据标准品覆盖的浓度范围进行待测样本浓度的推测。

2、相对定量：是用来确定经过不同处理的样品之间的表达差异或目标在不同时相差的表达差异，也就是倍数差异。

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