你养的细胞，可能又被支原体污染了？

分离培养法

分离培养法是从可疑的细胞培养体系中取样，并接种到最适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体，它们就会在这种琼脂平板上疯狂生长，最终形成明显可见的特征性菌落。分离培养法基本不会出现假阴性结果，因此被誉为支原体检测金标准。不过分离培养法也存在两个弊端：

1、检测时间太长，支原体要长出明显克隆至少需要4周时间。

2、尽管它可以检测绝大多数支原体种类，但也有力所不及的时候，比如分离培养法就不能检出支原体M. hyorhinis菌株的存在。

酶学检测法

酶学检测是将可疑样本添加到特定底物中，在这一体系内支原体的酶可以将ADP转化为ATP，随后能利用ATP发光的luciferase酶就可以指示支原体的存在。

ELISA检测法

ELISA也能用于支原体检测，以ELISA法为基础的支原体检测一般使用针对支原体16S rRNA基因的带标记探针或抗体，来检测培养物中是否含有支原体。

DNA荧光染色法

需要将可疑样品与指示细胞共同培养，因此一般需要几天时间。DNA检测所用的指示细胞通常是细胞质区域较大的Vero细胞，如果原样本中含有支原体，那么当细胞DNA被荧光染料（如Hoechst染料）染色时，就可以在指示细胞的核周围观察到荧光斑点或荧光颗粒。DNA法则可以准确的将分离培养法不能检测的支原体M. hyorhinis菌株检测出来。国际支原体组织（IOM）推荐分离培养法和DNA荧光染色法作为常规检测方法。

但最近PCR法的发展令人鼓舞

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PCR检测法

PCR法检测支原体只需几个小时，是最快也是最灵敏的支原体检测方法。该方法采用针对支原体DNA的引物用PCR检测可疑样本，其中PCR引物通常针对支原体的16S rRNA基因。在凝胶电泳过程中，支原体DNA会显示为特异性条带，以此指示支原体的存在。PCR法可以检测大多数支原体，但谨慎起见最好同时使用另一种检测方法来进行验证。

-15 ~ -25℃保存，自检定合格之日起有效期为12个月。

收取待检样品

贴壁细胞：待细胞生长至80%左右即可，使用细胞刮刀刮取细胞（送检细胞不能用消化液消化细胞）。

悬浮细胞：待细胞生长至80%左右即可直接进入下一步离心。

注：一般以6孔板接种细胞，当细胞生长至80-90％时即可取样进行检测。培养液中的青霉素和链霉素不会影响检测效果。

1000 rpm离心5 min，弃上清，留100-200 μl培养基重悬细胞，沸水浴10 min。

将煮沸的细胞悬浮液12000 rpm离心3-5 min。

所得样品取4ul直接用于PCR检测，或冻存于-20℃备用。

充分融化PCR反应液，按照下表配制PCR反应体系：

将所有PCR反应管放入PCR仪，按照以下参数运行PCR反应程序：

取5 ul PCR产物（无需再加溴酚蓝），进行1%琼脂糖凝胶电泳：110V电泳20-30 min，根据电泳仪情况，适当调整电泳参数。

支原体阳性细胞扩增片段在270 bp左右

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电泳参考图

（M：marker，+：阳性，-：阴性，1-3：检测为阳性的细胞，4-5：检测为阴性的细胞）

使用该试剂盒还有一些

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  使用试剂盒前请仔细阅读说明书全文。

为保证结果可靠性，建议每次实验都有阳性和阴性对照，每个反应各加4μl，阳性对照随试剂盒提供，阴性对照为灭菌ddH₂O，需客户自己准备。

操作时应尽量少说话，或带口罩，因口腔中也含有支原体，可能引起样品污染，而造成假阳性。

细胞培养物中含有青霉素和链霉素等抗生物素不会影响检测结果，如果用户需要进一步提高检测灵敏度，建议用不含双抗的培养基培养细胞2-3天后进行检测。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。