应用案例（质量光度计-MP）：质量光度计测量腺病毒AAVs的空壳与负载

应用案例（质量光度计-MP）：质量光度计测量腺病毒AAVs的空壳与负载

Mass photometry of AAVs

翻译整理：北京佰司特贸易有限责任公司     

腺相关病毒（AAVs）已被批准用于基因治疗——将遗传物质输送到靶组织。制备AAV介导的基因疗法的一个挑战是质量控制，尤其是空壳与负载（全衣壳）的比例。在这里，我们展示了如何在AAV血清型中使用质量光度计，以可靠且可重复地测量AAV样品纯度和空壳/负载比率。这些测量可以在几分钟内用少量样品进行。

目前正在寻求以AAVs为运载工具的基因疗法，以治疗帕金森氏症、遗传性失明、脊髓肌萎缩和血友病等疾病，取得了有希望的结果和良好的安全性。尽管在纯化过程中取得了进展，但由于缺乏快速可靠的方法来评估AAV的完整性、成功包装的遗传物质的数量以及宿主细胞和辅助病毒中蛋白质和核酸污染物的存在，AAV的生产受到阻碍。有缺陷或空的AAV是不受欢迎的，因为它们可以在治疗过程中竞争细胞受体，降低治疗效果，并导致意外的免疫反应。。

质量光度计适用于AAV分析

质量光度计测量单个粒子的质量，该测量既不受粒子大小也不受其形状的影响。由于AAV衣壳在负载时质量增加，但其大小和形状不变，因此质量光度计是量化AAV装载的理想方法（图1）。空载的和负载的AAV之间的差异可以使用质量光度计清楚地解决（图5）。质量光度计还可以检测AAV样品中的污染物，其质量往往较低（图1）。

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在用于量化AAV空壳/负载比率的替代方法中，最常见的是分析超速离心和透射电镜。然而，这些方法在技术上具有挑战性，涉及大量的样品工作，并且在成本以及分析所需的时间和样品量方面都很昂贵2。相比之下，质量光度计快速（测量一个样品大约需要一分钟），只需要很少的样品。在本应用说明中，我们演示了如何使用质量光度计来量化AAV负载和检测杂质。

质量光度计测定准确无误

首先，我们选择了一个模型，用质量光度计测量了空AAV5衣壳样品的质量分布。我们通过对同一样本进行六次独立测量来评估准确度，得出了高度一致的结果（Rg.2）。在每次质量光度计测量中，主峰对应于空壳，而较低质量的信号则表明存在污染物。AAV5衣壳分子质量的平均值和标准偏差为3.69+/-0.10 MDa。由于这些衣壳的预期分子质量为3.7 MDa，因此该结果具有极好的质量精度（2.7%）和高精度。

AAV血清型的质量光度计测定工作

AAV存在于许多亚单位组成和序列不同的血清型中。这些血清型特异性影响其免疫原性、向性和受体结合。因此，针对不同组织时，AAV血清型的选择很重要。除了自然出现的血清型外，还开发了合成血清型。一种人工合成的AAV-DJ结合了八种不同野生型病毒的序列，导致免疫原性降低；在体内，它以肝脏为靶点。

为了测试质量光度计是否适用于AAV血清型，我们测量了包含四种不同血清型（AAV5、AAV6、AAV8和AAVDJ）的空衣壳的样本。在每种情况下，都观察到一个单一的对称峰，大约3.7 MDa。获得的结果清楚地表明，质量光度计在血清型中产生一致的结果（图3）。

量化AAV空壳/负载比率

在描述AAV特征时，最重要的参数之一是空壳/负载比率，它反映了包含感兴趣基因组拷贝的衣壳的比例。为了探索如何使用质量光度计测量该参数，我们制备了含有不同数量的商用空和满AAV8衣壳制剂的混合物。然后，我们使用质量光度计测量每个混合物中满载衣壳的百分比（图4）。测得的百分比与预期值非常匹配（根据每种混合物中全衣壳制剂和空衣壳制剂的比例以及制造商关于每种制剂的信息计算得出）。混合物的预测负荷为空：0%；混合物1:32%；混合物2:48%；混合物3:63%；混合物4:95%。

含有空壳/负载AAV的混合物的质量分布有两个峰值（图4）。3.7 MDa左右的峰值对应于空衣壳，而较高质量的峰值对应于全衣壳。通过对峰值之间的对比度差进行DNA校准，可以确定全衣壳中DNA负载的质量（见下文）。

这些结果表明，质量光度计始终能够获得AAV制剂的负载百分比（或空壳/负载比率）的可重复和可靠测量值。

确定AAV装载物的质量

除了测量空壳/负载比率和识别污染物外，质量光度计还可用于量化AAV衣壳基因组装载物的质量。为了测量装载物的质量，我们假设两个峰值（空壳和负载）之间的质量光度计测定信号的差异是由于该装载物的存在。为了将这种差异转化为装载物的质量，我们在质量光度计计上对DNA进行了特定校准，因为DNA的折射率不同于蛋白质的折射率。总的来说，对重组蛋白的三组测量表明，使用质量光度计在单个分子水平上监测样本中的所有蛋白质物种，可以对难以分析的多步骤反应提供有价值的见解。

在AAV5衣壳的测量中，我们发现两个峰值之间AAV衣壳质量的平均差异对应于1.5+/-0.1 MDa的核酸量（图5），这非常接近4.8 kb基因组预测的1.6 MDa。

总结

质量光度计为评估AAV样品的质量提供了重要信息。通过使用质量光度计测量AAV样品中颗粒的质量分布，可以量化空/满AAV衣壳比，检测污染物并测量AAV装载物的质量。这些测量只需几分钟，使用很少的样品（这里使用20μL稀释至每毫升1x1011个颗粒的样品），并且只需要基本的实验室技能。总的来说，质量光度计可以作为一种快速可靠的AAV质量控制方法。