豌豆根瘤菌的培养条件与使用范围及保存方法！

豌豆根瘤菌，革兰氏染色阴性；生长速度较快，菌落为圆形，半透明，粘稠；利用碳源较为广泛，能利用硝态氮、氨态氮和有机氮为氮源生长；在甘露醇或其它碳水化合物培养基上生长产酸，产生大量胞外多糖粘液。

一、菌种简介

规格：甘油

拉丁属名：Rhizobium Leguminosarum

中文名称：豌豆根瘤菌

拉丁名称：Rhizobium leguminosarum

来源历史：中国普通微生物菌种保藏中心

收藏时间：2021-03-01 00:00:00.0

原始编号：USDA 2370

原产国：中国

模式菌株：是

生物安全级别：一级

其它保藏中心编号：CGMCC 1.2553

培养基编号：9.0

培养温度：28-30℃

培养时间：24h-48h

需氧类型：好氧

保存方法：冷冻干燥管保藏

用途：模式菌株

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用产品信息以出库为准

二、储存条件

冻干菌种和试管斜面请置于 6-10℃冷藏。

三、培养条件

根瘤菌培养基

酵母提取物 1.0 g 甘露醇 10.0 g 土壤提取液 200 ml

琼脂 15.0 g 蒸馏水 800 ml pH 7.2

土壤提取液：土壤 50 克 加水 200ml 121℃蒸煮 1 小时 过滤后加水补足到 200ml

四、使用范围

（1）合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，酿酒酵母菌组成成分精确，重复性强，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。

（2）天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，培养效果好，所以常被采用。

（3）半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。

五、注意事项

1、菌种常规培养时间：细菌 1-2 天，酵母 3 天，霉菌 5-7 天，大型真菌 7-10 天。

2、菌种恢复培养前，建议将收到的菌种安瓿保存在 6-10°C 的环境下，某些菌种经过冷冻干燥保存后处于休眠状态，延迟期较长，如在说明建议的培养时间还未长起来，请继续在相应的环境下多培养 24 小时或者更长时间，直至菌种培养完成，有的菌种需要连续两次继代培养才能正常生长，一般来说菌种培养稳定后才能用于您的后续实验。

3、初次使用时请严格按照本说明书推荐条件和操作步骤进行复活培养，如使用其它类型培养基或培养条件造成菌种不活等损失，我单位不负责任。

4、恢复培养厌氧菌时，在操作过程中应严格控制厌氧条件：制作培养基时，应使用厌氧螺口试管，并利用高纯氮气去除试管和培养基中的氧气，使用者应保证菌种的安全存储和操作，带菌废弃物应高压灭菌处理后丢弃。

六、保存方法

1、低温存法

①简单保存法，将琼脂斜面孢子培养物、菌丝悬浮液以及由麸皮、大米、小米等谷物原料制成的孢子培养物置于4℃冰箱保存,保存时间不超过1～2个月，若将谷物原料制备的孢子瓶抽真空并在棉塞上浸蜡,以隔绝外界空气和水汽,保持时间可达3～4个月；

②液氮超低温保存法，将生长稳定期的细胞悬浮在10%甘油或其他低冰点液体中，密封于安瓿管内，然后控制冷却速度，使安瓿管温度逐步下降至 -35℃时，即可置于-150～-196℃的液氮罐中保存。大多数微生物如病毒、噬菌体、多种细菌、放线菌、酵母和原虫、特别是一些用冷冻干燥法有困难的微生物，都可用此法长期保存。

2、脱水存法

①沙土保存法，能产孢子的细菌、放线菌及霉菌可采用此法保存,即将沙和土以3:2比例混合，经稀酸处理洗净过筛,装入小试管内,装置高度为1cm;灭菌2～3次，烘干后即可将在斜面培养基上生长良好的孢子，用无菌蒸馏水2～2.5ml制成孢子悬液，吸取少许加入沙土管中，经真空抽干，外观呈松散状态,于4℃冰箱保存，保存期可达5～7年。

②冷冻干燥法,将孢子悬浮液与保护剂（一般用脱脂牛奶或血清）相混合，放在安瓿管内于-20～-30℃的乙醇浴中速冻。然后，在低温下用真空泵抽干，并用五氧化二磷或干冰使水汽结冻，熔封安瓿管，于低温下保存。保存期可达5～10年之久。

③石蜡油封存法，在斜面菌种培养物上,倒上灭菌后的石蜡油，高出斜面1cm，于4℃冰箱或低温干燥处保存，此法不适用于能利用石蜡油作碳源的微生物，保存期为一年以上。