【答疑解惑】一直被忽略的NK细胞培养重要靶点

NK细胞作为免疫肿瘤学治疗领域的经典免疫细胞疗法重要组成部分，已被广泛应用于各种恶性肿瘤疾病的治疗和提升免疫力等领域。在面对癌细胞时，自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK cell）不需要其它细胞的激活与致敏，便能直接识别并杀死癌细胞。因此，NK细胞也被称为人体抗癌第一道防线的重要参与者，并在肿瘤的免疫细胞治疗方面有着长期的应用和良好的发展前景。

NK细胞抗肿瘤治疗潜力

早在上个世纪70年代，科研人员就开始了对NK细胞展开系统性的研究，但直到最近20年，人们才逐渐了解NK细胞在帮助抗击肿瘤和其它疾病方面的复杂机理和治疗潜力。

2000年，科学家通过研究证实了小鼠肿瘤的发生与NK细胞自身的缺陷有关；2013年，有研究者对多达3500名癌症患者采用了NK细胞疗法，在随后的跟访中，发现了NK细胞的活性越好、癌症治疗效果会更好的现象，同时也发现NK细胞疗法能降低癌症复发的风险。这项研究发现，无论是在胃癌、神经母细胞瘤还是结直肠癌患者群体中，都能得出相同的结论。而在近年的临床治疗中，科学家们发现，NK细胞疗法已经被广泛用于各种癌症的治疗，包括但不限于：血液系统肿瘤、神经母细胞瘤、卵巢肿瘤、横纹肌肉瘤、乳腺癌、胃癌等，且均取得了积极的临床治疗效果。

NK细胞在抗肿瘤方面究竟是如何发挥作用的呢?

NK细胞之所以被认定为固有免疫的核心细胞，是因为其具有重要双重功能：细胞毒性和免疫调节作用。首先，NK细胞不受MHC限制，不需要先由抗原致敏，也不用抗体参与，就能够通过死亡受体或直接释放穿孔素、颗粒酶来清除肿瘤细胞；其次，它在免疫系统中利用分泌细胞因子和趋化因子来激活适应性免疫活动的发生。

NK细胞这两个特点也让其在对抗癌症的治疗方面占据了非常重要的地位，从而让NK免疫细胞疗法成为治疗肿瘤的可能。而NK细胞的激活依赖于NK细胞表面表达的抑制性受体和激活性受体之间的平衡，它们则与肿瘤细胞上的配体相互作用[1]。

NK细胞扩增方式解析

通常，NK细胞主要有四种来源，分别是：外周血、诱导多能干细胞、NK细胞系（NK-92）以及间充质干细胞。但人体内NK细胞数量很少，仅占外周血的5% ~ 10%；此外肝脏、肺脏、胸腺、淋巴结等部位也可见少量NK细胞的存在；在脾脏内的细胞中，NK细胞也维持着3%~4%的比例。

因为稀缺的NK细胞如此重要，所以在实验中，科研人员开发了很多种NK细胞的扩增方法，用于研究NK细胞的各种功能以及外界刺激对NK细胞介导的免疫活动的影响。目前，NK细胞扩增的方式主要包括细胞因子扩增法、饲养层细胞扩增法以及超抗原刺激法。其中IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21以及IFN-γ是NK细胞增殖和促进其分化成熟、发挥细胞毒性的重要调节因子，在体外培养中可以刺激NK细胞的增殖和活性，其中IL-2和IL-15的作用尤为明显。而饲养层细胞扩增法常见的添加物为慢性髓性白血病K562细胞和经刺激的自体PBMC细胞（即外周血单个核细胞）[2]。大量高纯度、高活性NK细胞的扩增是其用于治疗的秘密所在。

尤其以PBMC（或以Magnetic beads分离的NK细胞）为原材料进行扩增时，通过特定细胞因子的刺激，使NK细胞在体外得到特异扩增，这种方法是目前被认为比较有应用前景的方法之一[3，4]。通过体外的刺激培养可进行相对大规模的NK细胞制备，从而保障临床治疗工作的开展。

NK细胞扩增方式比较

如何让NK细胞更有效扩增呢？

01、IL-12

2022年8月，来自加州大学的研究者们在《J. Exp. Med.》期刊上发表了题为“Differential IL-12 signaling induces human natural killer cell activating receptor-mediated ligand-specific expansion”的文章[5]。

低浓度IL-12可促进长期培养的IL-2原代NK细胞NK受体配体特异性扩增

该项研究结果表明，低浓度的IL-12可以有效激活NK受体从而介导NK细胞的扩增，并促进NK细胞表达的持久性，从而为IL-12信号在建立人类NK细胞配体特异性记忆特征中的作用提供帮助，并可能有助于实现IL-12和NK细胞联合应用于癌症的免疫治疗。

02、IL-15/IL-21

2009年，在《Cancer Research》期刊上，Wing等人发表了一篇以“EXPANSION OF HIGHLY CYTOTOXIC HUMAN NATURAL KILLER CELLS FOR CANCER CELL THERAPY”为题的文章[6]，该项研究工作主要介绍了一种从PBMC中优先扩增NK细胞的实用方法。

Wing等人证明了这些细胞表面活化和抑制NK细胞受体的表达增强，并使其细胞杀伤能力也得到极大的增强（1－3周后，NK细胞的杀伤能力达到高峰，然后下降，但仍比静止NK细胞高）。同时，还证实了STAT3信号通路在这些NK细胞诱导中的作用，并发现了IL-21是STAT3信号通路强有力的活化剂；IL-15是STAT5的强活化剂，但是对STAT3活化能力稍弱。然而，IL-15已被证明可诱导STAT3活化因子IL-10的高表达。因此，这些发现对于临床扩增NK细胞很有帮助意义。

小结：目前，无论是国外还是国内，NK细胞免疫疗法在肿瘤治疗领域都取得了重大突破，但大多候选药物仍处于较为早期的临床试验阶段。根据已有的相关临床结果表明，我们深知NK细胞治疗的有效性与安全性，也能预测NK细胞免疫疗法的“远大前程”。我们深信，在不久的将来，关于NK细胞的扩增与抗肿瘤活性也会得到普及，NK细胞治疗的前景在未来将值得被广泛期待！

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参考文献：

[1]Adapted from Cancer Immunol Immunother 2020 May,69(5):879-899

[2]Gong, Y., et al., Chimeric antigen receptor natural killer (CAR-NK) cell design and engineering for cancer therapy. Journal of Hematology & Oncology, 2021. 14(1): p. 73.

[3]Klingemann HG and Martinson J.Ex vivo expansion of nature killer cells for clinical applications [J].C ytoth erapy,2004, 6(1):15-22.

[4]李晓红，马健，汪菲菲，等.体外扩增高纯度的人外周血来源的NK细胞的研究[J].中国实验血液学杂志，2007，15(2)：373-377.

[5] Avishai Shemesh et al. Differential IL-12 signaling induces human natural killer cell activating receptor-mediated ligand-specific expansion. J Exp Med. 2022 Aug 1;219(8):e20212434. doi: 10.1084/jem.20212434.

[6] Expansion of highly cytotoxic human natural killer cells for cancer cell therapy. Fujisaki H, Kakuda H, Shimasaki N, Imai C, Ma J, Lockey T, Eldridge P, Leung WH, Campana D. Cancer Res. 2009 May 1;69(9):4010-7. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-08-3712. Epub 2009 Apr 21.

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