Science子刊 | cf-mRNA高通量测序揭示阿尔茨海默病分子特征
阿尔茨海默病（AD）是痴呆最常见的病因，严重影响着全世界众多患者的身心健康。虽然现有药物可以快速控制AD患者症状，但仍没有方法治愈AD。此外，由于缺乏非侵入性检测手段来检测大脑中发生的分子变化，限制了人们对AD病因及进展的理解，也限制了有效治疗策略的制定。因此，加速开发可用于评估AD患者脑内分子变化的无创检测方法具有重要意义。
人类死后脑组织的基因表达谱研究表明，AD是一种异质性疾病，AD患者的转录谱与健康个体有本质上的差异。在转录组水平上了解认知障碍患者的特征有助于阐明AD的病因，从而提高AD患者管理和药物开发的准确性。
越来越多的证据表明RNA分子可以穿过血脑屏障，血浆循环cf-mRNA包含来自多个器官(包括大脑)的转录本，并可用于评估器官特异性转录变化。因此，来自大脑的循环cf-mRNA有望作为探索神经疾病(如AD) 分子特征的非侵入性生物分析工具。
基于此，美国圣地亚哥的Molecular Stethoscope公司科研团队开展了相关研究。研究人员对AD患者的血浆cf-mRNA进行了高通量测序分析，确定了AD患者血浆中的基因转录差异，以及与痴呆严重程度相关的基因。这些基因在与AD相关的生物过程中富集，如突触功能障碍、线粒体功能障碍和发炎。此外，研究人员利用血浆循环中的差异基因对AD患者的病理亚型进行分类，并构建了基于cf-mRNA的分类机制，可以有效地区分AD患者和对照组。最新研究结果于近日发表在了Science Advances上。
文章发表在Science Advances上
研究内容和研究结果
研究人员对126例AD患者和116例对照（NCI）血浆中的cf-mRNA进行了高通量测序,被鉴定出的蛋白编码基因中位数为11,714个。研究者共鉴定了2,591个基因在AD和NCI组之间的差异表达,其中2,057个基因表达下调，534个基因表达上调。
图1. 差异表达基因。来源：Science Advances
接下来，研究人员使用独创性路径分析（Ingenuity Pathway Analysis）评价这些差异表达基因所反映的功能作用和生物学过程。研究显示，AD患者中下调基因多与神经系统功能相关，且相当一部分为脑特异性基因；而上调基因在与免疫应答激活、线粒体活性、蛋白质稳态相关的通路中显著富集。GO生物学过程富集分析证实，AD患者中被下调的基因与神经元功能相关，而上调的基因在免疫应答和RNA剪接相关过程中富集。
图2. 使用IPA标准通路分析确定的10个重要通路。来源：Science Advances
为了进一步了解AD患者cf-mRNA的变化是否反映了大脑中的相关转录变化，研究人员将发现的差异表达基因与先前的RNA-seq数据集中发现的差异表达基因进行了对比，该数据集检测了死后AD患者海马区的转录变化。研究者发现血浆中的上调和下调基因组与报道的脑组织中基因组具有显著的一致性。脑组织的cf-mRNA和RNA-seq对比分析后发现的分子通路有大量重叠。这些数据共同表明，循环转录组捕获了AD患者大脑的转录变化。
此外，研究人员还探究了AD患者血浆循环中的失调基因是否可以归类为特定的功能簇。研究结果显示，这些基因可被划分为6个簇，均与AD的发生和发展有关。这些数据表明，结合详细的疾病特征和患者结局信息，cf-mRNA表达谱可用于AD患者的非侵袭性病理分型。
图3. 通过对每个聚类的基因集富集分析，确定最重要的三个通路(IPA)。
来源：Science Advances
另外，为更好地了解AD患者通路的改变与痴呆严重程度的关系，研究人员调查了这些基因簇是否与患者临床痴呆评分(CDR)分数相关。结果表明，簇3(突触传递)和簇5(免疫反应和神经炎症)与CDR评分显著相关。其中，突触传递基因簇表达随着CDR评分的升高而降低，而免疫反应和神经炎症反应的表达水平随着CDR评分的升高而升高。
在上述观察的基础上，研究人员评估了表达水平与疾病严重程度显著相关的个体基因。研究者发现了246个与CDR评分相关的基因，GO富集分析表明，这些基因主要参与AD相关的RNA剪接、氧化磷酸化和线粒体功能障碍等生物过程。
图4. 按CDR等级分类的突触传递、免疫和炎症反应簇的表达。
来源：Science Advances
为了确保与认知障碍相关的基因是一致的，研究人员使用另一种广泛用于认知障碍评估的临床指标—迷你精神状态测试(MMSE)评分重复了同样的分析。与MMSE评分相关的基因有1,186个，与CDR和MMSE评分相关的基因明显重叠。同样，使用这些基因识别的分子通路也有显著重叠。
图5. ROK2的表达与CDR(左)和MMSE(右)评分的关系。来源：Science Advances
最近的组织RNA-seq数据显示，在患有轻度认知障碍个体的神经元中可以检测到明显的疾病相关转录组变化。因此，研究人员检测轻度或极轻度AD患者的cf-mRNA中是否能检测到疾病相关基因特征。研究人员使用CDR评分鉴别AD患者是否患有轻度或极轻度痴呆。研究结果表明，在“早期”AD患者中下调的基因主要富集于神经系统功能和发育过程，上调基因则主要富集在在免疫反应和蛋白稳定过程。
最后，研究人员试图建立分类机制，用于区分AD患者和NCI患者。为了最小化偏倚和过度训练，首先使用来自肯塔基大学的样本，通过L2正则化logistic回归(control n = 24和AD n = 66)建立一个单独的分类器。选取肯塔基大学唯一队列中发现的1,658个差异表达基因作为分类器的输入特征。这组基因与2,591个失调的基因明显重叠。分类器中表现的生物途径包括与AD发病机制有关的免疫反应和细胞代谢过程。
图6. 基于cf-mRNA的分类器可以区分AD患者和对照组。来源：Science Advances
总结
该研究表明高通量cf-mRNA测序在评估AD相关大脑病理生理改变方面的潜力，可以为改善AD患者病情管理提供可能的精准医疗解决方案。
参考文献：
Toden, Shusuke et al. “Noninvasive characterization of Alzheimer's disease by circulating, cell-free messenger RNA next-generation sequencing.” Science advances vol. 6,50 eabb1654. 9 Dec. 2020, doi:10.1126/sciadv.abb1654
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