DIA技术
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- 2023-08-14 14:49:05
上海欧易生物医学科技有限公司
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数据非依赖采集（data independent acquisition，DIA）是近年来备受瞩目的质谱采集技术之一。
DIA相比于DDA的优势在于可以测定复杂样品中丰度低的蛋白分子，大大提高了定量分析的可信度。其原理是在质谱数据采集时，高速、循环的将每个采集窗口内的所有母离子及其子离子碎裂后进行全扫描，而非根据母离子信号强度筛选后进行二级碎片再扫描[1, 2]。因此DIA具有高通量、高分辨率、高可重现性、定量准确等优点，而且样本无需分级上机，大幅缩短了每个样品的检测时间，适合大样本量的蛋白质组研究。但由于DIA获得的是几乎没有任何丢失的所有离子信息，数据量及其复杂性大大增加，数据分析难度加大。目前主流的数据分析是基于 DDA/DIA 构建的谱库和实验产生的 数据对样品中的蛋白质进行鉴定和定量。公共的谱库可以从各大蛋白质组研究数据平台下载，但对于一些特异性的样本，为了有更好的鉴定结果，还需要通过实验样本建立DDA参考数据库。
实验原理
提取的蛋白酶解之后，利用液质联用技术对肽段进行质谱分析，通过比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。每条肽段的丰度（量）与其在质谱中的峰面积或信号强度成正比；而不同样品的同一条肽段在LC上的保留时间（retention time， RT）是一致的，因此，可以通过对比谱图库中的信息，再整合到相应蛋白，实现对蛋白质在不同样本中的相对表达水平的定量分析[1, 2]。
技术的特点
（1）重现性好：采集所有离子及碎片谱图，不丢失任何信息；
（2）选择性好：基于碎片离子（即母子离子对）定量，与 SRM/MRM 相当；
（3）准确度高：循环时间固定，扫描点数均匀，定量准确度高；
（4）通量高：同时监测所有目标蛋白/ 化合物，通量无上限；
（5）时效性强：对于易降解样品可以即刻采集，获得数据后再深入挖掘；
（6）数据易追溯：即使目前的水平无法发现某些蛋白/化合物，未来可以回溯；
实验流程
（1）从样本中提取蛋白并用BCA法或Brandford法进行蛋白的浓度测定；
（2）SDS-PAGE检测蛋白质完整度；
（3）每个样品取等量蛋白质进行酶解；
（4）对酶解后的肽段使用反向色谱柱，进行组分分离；
（5）加入混合标肽段（保留时间校正）；
（6）酶解后的多肽进行DDA建库，并对DDA建立库数据整理。。
（7）使用DIA模板，进行液相色谱串联高分辨质谱（LC-Orbitrap MS）采集，获得高质量DIA数据。
（8）对DIA数据进行处理，得到可信蛋白、筛选差异表达蛋白、差异蛋白生物信息学分析。
图 DIA操作流程
服务流程
