产品描述

PKH67细胞连接试剂盒（用于常规细胞膜标记）（PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling）是一款基于荧光探针PKH67，用于常规细胞膜标记的检测试剂盒，适用于体外细胞标记，体外细胞增殖以及长期的体内细胞跟踪研究等。

PKH67是一种专利的膜标记探针，与PKH1和PKH2相比，结构上带有更长的脂肪族碳尾，能稳定插入细胞膜脂质区域。正因具更长碳尾，内部数据连续性证明：PKH67具有比PKH2更低的细胞-细胞间转运发生。PKH67呈绿色荧光（见图1），最大激发波长为490nm，最大发射波长是502nm，与标准荧光素（Fluorescein）滤片兼容。PKH67非常适合用于细胞毒性实验，与碘化丙啶（PI，CAT:#FS1202）或7-氨基放线菌素D（7-AAD，CAT:#FS1213）这些细胞活力探针联合使用。根据染料稀释原理，PKH67常用于细胞增殖监测分析，包括抗原特异性的前体频率和带干细胞特性的静息/缓慢分化肿瘤细胞的鉴定。也能用于监测外泌体或脂质体吞噬，细胞-细胞膜转运、吞噬、抗原递呈，以及体内细胞运输研究。

以不分裂细胞为研究对象，通过对体外细胞膜滞留周期和体内荧光强度减弱频率的关联性分析，预测PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。这与PKH1和PKH2的体内半衰期相近，这两个探针都成功用于监测周期长达1-2个月的体内淋巴细胞和巨噬细胞运输研究，因此，PKH67适用于需要绿色荧光细胞连接染料的短-中期体内示踪研究，以及体外细胞毒性、吞噬、增殖、抗原递呈，或其它共培养实验。

稀释液C（Diluent C）是本试剂盒配套提供的一种水溶性溶液，特别设计的一种标记媒介能维持细胞活力，同时最大化染料溶解性和标记过程中的染色效率。Diluent C对哺乳动物细胞来说是等渗的，不含去污剂或有机溶剂，也不含生理盐和缓冲剂。根据细胞类型，染料标记后膜的内在化程度，标记细胞可能呈现不同的状态，从明亮，到均匀点状或斑驳状。然而，PKH67荧光在生理范围内不依赖于pH，且每个细胞的荧光强度通常不受染料位置的影响。

图1. PKH67的激发和发射光谱图

FUSHENBIO(复申生物)PKH67细胞连接试剂盒Mini Kit其中100UL规格建议用于小量或初步研究。当使用2ml染色体积（含2μM终浓度的PKH67），本试剂盒含有足量的染料用于检测25次细胞样本（2×107个细胞/次），和足量的Diluent C用于5次细胞样本（2×107个细胞/次）；200UL规格适用于中量研究，比如体外细胞增殖或毒性研究。当使用2ml染色体积（含2μM终浓度的PKH67），本试剂盒含有足量的染料用于检测50次细胞样本（2×107个细胞/次），和足量的Diluent C用于30次细胞样本（2×107个细胞/次）；

 

1ML规格适用于大量或体内研究。当使用2ml染色体积（含2μM终浓度的PKH67），本试剂盒含有足量的染料用于检测125次细胞样本（2×107个细胞/次），和足量的Diluent C用于30次细胞样本（2×107个细胞/次）。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

操作步骤

1. 自行准备仪器和试剂（试剂盒不提供，用于常规细胞膜标记）

﹒良好分散，均匀的单细胞悬液（悬浮于组织培养基）

﹒含血清的组织培养基（完全培养基）

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培养基，或生理盐溶液（比如，DPBS或HBSS）

﹒血清，白蛋白或其他系统兼容的蛋白

﹒聚丙烯锥底离心管（4-15ml）

﹒能控温的离心机（高达1000×g）

﹒荧光分析用仪器（荧光酶标板，荧光或共聚焦显微镜，流式细胞仪）

﹒无菌层流净化罩

﹒血球计数板或自动细胞计数装置

﹒载玻片和盖玻片

2. 常规细胞膜标记

【染色流程】：

以下操作流程使用2ml最终染色体积，含2μM PKH67，以及1×107个细胞/ml。

以下所有步骤都在室温下进行（20-25℃）。

1. 取一锥底聚丙烯离心管制备2×107个细胞的单细胞悬浮液，用无血清培养基清洗细胞一次。

2. 400×g离心细胞5min，得到松散的细胞沉淀。

3. 细胞离心后，轻轻吸掉上清。注意不要移动任何细胞并且残留不超过25μl上清液。

4. 加1ml Diluent C到细胞沉淀中制备成2×细胞悬液，用枪轻轻吹匀以确保完全分散。不可涡旋和不可让细胞长期保留在Diluent C中。

5 染色前立即制备2×染色液（4μM in Diluent C）：通过将4μl PKH67乙醇储存液到1ml Diluent C中，充分混匀分散所得。

6. 快速加1ml2×细胞悬液（Step 1.4）到1ml2×染色液（Step 1.5），用枪立即混匀样本。混匀后样本得到的终浓度是1×107个细胞/ml和2μM PKH67。

7. Step 1.6中的细胞/染料悬液孵育1-5min，中间定期混合。染色过程非常快，更长时间无任何益处。

8. 加入等体积（2ml）血清或其他适当蛋白溶液（比如1% BSA）终止染色，孵育1min允许结合多余的探针。

9. 20-25℃，400×g离心细胞10min，轻轻吸掉上清，确保不会移动细胞。用10ml完全培养基重悬细胞，转移到一个干净无菌的锥底聚丙烯离心管中，20-25℃，400×g离心细胞5min。然后用10ml完全培养基清洗细胞沉淀＞2次，以确保完全去除未结合染料。

 

10. 最后一步清洗后，用10ml完全培养基重悬细胞沉淀，用来评估细胞回收，细胞活力和染色强度。离心和重悬沉淀到一理想终浓度的活细胞悬液。

注意事项

1)  PKH67是以溶于乙醇的储存液形式提供，保存的过程中需避光并拧紧盖子，以防止溶液挥发引起的染料浓度提高。使用前需检查是否有结晶，若有结晶，需在37℃水浴溶晶，超声或涡旋直至完全溶解。

2)  Diluent C使用前需置于室温回温之后再配制标记用的细胞和染料工作液。Diluent C是无菌溶液，不含任何防腐剂或抗生素，使用和保存过程中都注意无菌。

3) PKH67不能保存在Diluent C内，保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制，现配现用。

4)  荧光染料均存在淬灭问题，操作和储存过程中需注意避光，以减缓荧光淬灭。

5)  为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。