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Crispr-Cas脱靶检测-GUIDE-Pro(Seq)
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  • 2022-12-12 14:12:41

珠海舒桐医疗科技有限公司

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GUIDE-Pro(Seq)体内脱靶检测及高通量筛选有效sgRNA

自2013年初发现CRISPR-Cas9在细胞内实现DNA精确编辑开始,该技术近年呈井喷式发展。相对于ZFN、TALEN等基因编辑技术来说,其更加简单、经济、容易操作,一般的实验室都可以构建自己的平台。令其成为迄今为止最为有效、低廉和容易的基因编辑方法。但目前CRISPR/Cas9的应用主要面临两大问题:其一是存在脱靶效应,严重影响了其临床应用;其二是sgRNA设计软件种类繁多,各有优劣。软件设计出的sgRNA需要进一步进行实验筛选,浪费了大量时间和金钱。

基于此,我们开发了一种高通量的、高敏感性和特异性的、同时检测切割效率和脱靶效应的有效sgRNA筛选方法——GUIDE-Pro(seq)。是基因编辑研究中不可或缺的脱靶检测方法,也是广大科研人员进行sgRNA筛选的利器。

脱靶检测原理及实验流程

舒桐升级版GUIDE- Pro优势

  1. 直接在活细胞体内进行检测,切割效率和脱靶效应更加符合实际;
  2. 更高的敏感性及特异性;
  3. 更高的性价比:常用于基因编辑实验中有效sgRNA的筛选,同时获得不同sgRNA的在靶和脱靶数据,为后续实验提供有效支撑,大大降低后续实验及时间成本;
  4. 更高的灵活性:除了CRISPR/Cas9,同时我们也成功开发了针对TALEN及ZFN的脱靶检测技术及分析流程;
  5. 更短的服务周期:从准备细胞到最终可视化结果呈现,仅需半月。

舒桐升级版GUIDE-Pro的应用场景

  1.  设计多条sgRNA后,利用GUIDE-Pro筛选切割效果最高,或者脱靶最低的sgRNA;无需再进行传统的耗时耗力的低通量筛选验证;
  2.  针对前期实验已经获得的有切割能力的sgRNA,需要进一步明确其体内脱靶效应;
  3. 基因编辑治疗过程中治疗效果及脱靶效应的检测。

实验示例:GUIDE-Pro VS. GUIDE-seq

  1. 我们通过检测相同位点在相同数据量条件下的脱靶,结果显示:升级版GUIDE-seq的在靶reads数更高(≥1倍),脱靶reads数也提高了≥4倍。更为重要的是,GUIDE-Pro可以找到更多的脱靶位点。大大的提高了脱靶检测的敏感性和特异性。
  2. 相较于传统GUIDE-seq,本公司研发的GUIDE-Pro技术性价比极高。常用于基因编辑实验中有效sgRNA的筛选,同时获得不同sgRNA的在靶和脱靶数据。为后续实验提供有效支撑,大大降低后续实验及时间成本。
  3. 成功开发了TALEN及ZFN脱靶检测流程:目前全国乃至全世界均无有效的检测TALEN及ZFN基因编辑方法的检测手段,我们通过对实验及分析流程的不断改进,成功开发了针对TALEN及ZFN的检测方法。

服务内容

服务项目 内容 周期 价格 交付形式
GUIDE-Pro sgRNA质粒构建+建库+测序+分析 20-30个工作日 8000元 sgRNA质粒+原始数据+可视化结题报告

样品要求

  1. 可提供目标基因序列,由我公司免费设计sgRNA;
  2. 或由客户仅需提供sgRNA序列,由我公司构建sgRNA质粒。或者提供sgRNA质粒即可,由我公司进行转染及后续建库测序;实验用细胞系由客户提供;
  3. 若提供电转后的DNA,则需要DNA样品总量:5ug以上,浓度50ng/ul以上。DNA样品纯度:OD260/280=1.8~2.0 。DNA样品完整性:DNA无明显降解,需提供凝胶电泳检测胶图。
  4. 客户需检测ODN是否插入,若需我公司完成则需提供靶点信息。

参考文献

  1. Ling, X. et al. Improving the efficiency of CRISPR-Cas12a-based genome editing with site-specific covalent Cas12a-crRNA conjugates. Mol Cell 81, 4747-4756 e4747, doi:10.1016/j.molcel.2021.09.021 (2021).
  2. Cui, Z. et al. The comparison of ZFNs, TALENs, and SpCas9 by GUIDE-seq in HPV-targeted gene therapy. Mol Ther Nucleic Acids 26, 1466-1478, doi:10.1016/j.omtn.2021.08.008 (2021).
  3. Fan, W. et al. Non-homologous dsODN increases the mutagenic effects of CRISPR-Cas9 to disrupt oncogene E7 in HPV positive cells. Cancer Gene Ther, doi:10.1038/s41417-021-00355-z (2021).

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