细胞凋亡实验（TUNEL法）

一、技术简介

细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。凋亡是多基因严格控制的过程。

TUNEL法（terminal dexynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定法），也称DNA断裂的原位末端标记法。细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300 kb的大片段，然后大约30%的染色体DNA在Ca²⁺和Mg²⁺依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200 bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，再用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与衍生物上生物素结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个生物素分子），最后用DAB、过氧化氢与辣根过氧化物酶发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。

二、实验流程

1. 收集处理后的细胞或石蜡切片脱蜡至水。

2. 过氧化氢甲醇中浸洗，抑制内源性过氧化氢酶。

3. 用蛋白酶K室温孵育15~30分钟。

4. 滴加TUNEL反应混合液（即配即用，4℃避光），孵育60分钟，在荧光镜下（绿色）分析结果。

5. 加入转化剂-POD，孵育20~30 min。

6. 加入DAB底物溶液，孵育5~10 min。

7. 中性树胶或者甘油封片，光镜下分析结果。

三、服务说明及结果

1. 客户提供：细胞、所需药品；或者其他标本。

2. 公司提供：原始数据及分析结果、完整的实验报告。

3. 实验周期：10个工作日，具体需要根据细胞生长情况及实验内容而定。