His-Tagged Protein Purification Kit (Soluble Protein)
His 标签蛋白纯化试剂盒（可溶性蛋白）
产品货号：26421（5ml）
产品简介：
本试剂盒包含 Ni-Agarose 填料、亲和柱空柱以及可溶性 His 融合蛋白纯化所需的全部试剂（细菌裂解液、蛋白
酶抑制剂混合物、结合缓冲液和洗脱缓冲液组分），使用方便。该镍柱纯化系统对 6×His-tag 蛋白具有显著特异吸附
能力，能够高效一步纯化带有 6 个组氨酸亲和标签的蛋白。该系统具有 4 个 Ni2+螯合位点，较只有 3 个螯合位点的
Ni-IDA 结合 Ni2+ 更为牢固，有效防止纯化过程中 Ni2+脱落且增强对 His 标签蛋白的结合能力，提高纯化效率。较高
的基团密度，大大提高了蛋白载量。该系统在天然或变性条件下，对来源于各种表达系统（如杆状病毒，哺乳细胞，
酵母以及细菌）中的 His 标签蛋白，均有很好的纯化效果。本产品已螯合镍离子，可直接用可溶性蛋白的纯化，使
用方便，快捷。
支持物： CL-6B 琼脂糖凝胶
载量： 20-30 mg His 标签蛋白/ml 填料
粒径： 50-160 µm
产品内容：
产品名称 包装 储存条件
Ni-Agarose Resin 5 ml 2-8℃，避免冷冻
Bacterial Protein Extraction Reagent 65 ml 室温
1 M Tris-HCl（pH7.9） 15 ml 室温
1 M Imidazole 65 ml 室温
3 M NaCl 120 ml 室温
Protease Inhibitor Cocktail 700 µl -20℃
Affinity Column (12 ml) 1 set 室温
操作步骤：
Ⅰ缓冲液的准备
可溶性蛋白纯化缓冲液配方：
Component Tris-HCl（pH7.9） Imidazole NaCl
Soluble Binding Buffer 20mM 10mM 0.5 M
Soluble Elution Buffer 20mM 500mM 0.5 M
Ⅱ组装层析柱
1. 将 Ni-Agarose Resin 填料混匀后加入层析柱，室温静置 10 分钟，待凝胶与溶液分层后， 把底部的出液口打开，
让乙醇通过重力作用缓慢流出。
注意：
1）填料的上层是乙醇保护层，将填料和乙醇一起混匀，以每 ml 填料纯化 20-30mg His 标签蛋 白计算，取需要的填
料与乙醇的混合液加入层析柱。
2）如果乙醇不流出，可以给柱子一个外力，例如用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使乙醇流出。
3）本实验都是通过重力作用使溶液流出。
2. 向装填好的柱中加入 5 倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用 10 倍柱体积的 Binding Buffer 平衡柱
子，平衡结束后即可上样。
注意：柱体积指的是填料的体积。
Ⅲ可溶性蛋白的纯化
1. 收集菌体后，每 100 mg 菌体（湿重）加入 1-5 ml 细菌裂解液（每 1 ml 细菌抽提试剂中已加入 10 μl 蛋白酶抑制
剂混合物），超声裂解菌体。
注意：
1）当提取物粘度高或提取蛋白为包涵体时，建议加入 DNase I 和 Lysozyme。每 1 ml 细菌抽提试剂中加入 1 μl DNase
I（1,000 U/ml），2 μl Lysozyme（50 mg/ml）。
2）超声过程中保持菌液处于冰浴中，超声条件依赖于所使用的超声仪功率，探头种类，容器的大小形状，需实验中
自己摸索，应避免连续超声导致的大量产热，可分成短时间，多次超声，通过一定的间隔时间避免溶液过热。最终
菌液变清即可。
2. 10000 rpm,4℃离心 3 分钟，收集上清中的可溶性蛋白。
3. 用 Binding Buffer 将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱，流速为 10 倍柱体积/小时，收集流穿液。
注意：
1）本试剂盒中附带有一块筛板，使用时先将筛板加至填料的上层，该筛板可用于杂质较多的蛋白的过滤，防止过多
的杂蛋白堵塞柱子的作用。再将处理好的样品负载上柱，但是筛板放入柱子后就不易取出。
2）通过控制加入的菌体裂解液的速度来控制流速。
4. 使用 15 倍柱体积的 Soluble Binding Buffer 冲洗柱子，洗去杂蛋白。
5. 使用适量 Soluble Elution Buffer 洗脱，收集洗脱峰。
注意：洗脱峰可以分管收集，每 1 ml 收集 1 管，并采用蛋白监测仪监测，收集洗脱峰
6. 洗脱后，依次使用 10 倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用 3 倍柱体积的 20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），
封柱后 2-8℃保存。
注意：如果是分段梯度洗脱，最大洗脱缓冲液中咪唑浓度未达到 500 mM 时，则使用浓度为 500 mM 的咪唑进行
洗脱 10 倍柱体积后，再进行第 6 步的操作
Ⅳ柱再生
当填料使用多次后，结合效率会有所下降（表现为流速变慢或填料失去蓝绿色）， 可以用以下方法再生，提高
填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。
1. 使用 2 倍柱体积的 6 M 盐酸胍冲洗后，使用 3 倍柱体积的去离子水冲洗。
2. 使用 1 倍柱体积的 2% SDS 冲洗。
3. 依次使用 1 倍柱体积的 25%、50%、75%和 5 倍柱体积的 100%乙醇冲洗，再依次使用 1 倍柱体积的 75%、
50%和 25%的乙醇冲洗。
4. 使用 1 倍柱体积的去离子水冲洗。
5. 使用 5 倍柱体积含 50 mM EDTA 缓冲液（PH8.0）冲洗。
6. 使用 3 倍柱体积去离子水，3 倍柱体积 20%乙醇冲洗。
7. 2-8°C 保存。
8. 再次使用前，需首先使用 10 倍柱体积去离子水冲洗，然后使用 5 个柱体积的 50 mM NiSO4 再生，3 个柱体积的
Binding Buffer 平衡。
注意事项：
1. 在纯化之前采用电泳检测蛋白的可溶性，本试剂盒只适合于可溶性蛋白的纯化。
2. 缓冲液中不建议使用β-巯基乙醇、DTT 和 EDTA。
3. 整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。
4. 为提高纯化效率，首先确定 Binding Buffer 和 Elution Buffer 中咪唑的最佳使用浓度。必要时可以使用线性或梯度
浓度的咪唑浓度，Binding Buffer 的范围为 0-10 mM，洗脱缓冲液的范围为 10-500 mM 来进行。并通过 SDS-PAGE
或 Western Blotting 来检测目的蛋白的纯度。
5. 请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过 0.22µm 或者 0.45µm 过滤器过滤。为避免柱子被堵塞，建议将裂解液
进行离心，或者使用 0.22µm 或者 0.45µm 过滤器过滤。
6. 柱再生时，保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。