实时荧光定量PCR(real-time PCR)

一、技术简介

实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。

Real time PCR 的定量使用荧光色素，目前有二种方法。一种是在ds DNA中插入特异的荧光色素，例如SYBR Green荧光染料；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针（probe），如Taqman探针。两种方法原理不同。SYBR Green荧光染料游离时不发光，当反应体系中存在双链DNA时，SYBR Green与双链DNA结合，此时才发光。Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′－3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测到。real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”。

二、实验流程

1. 提取RNA。

2. DNAse I 消化样品RNA 中的DNA。

3. RNA琼脂糖凝胶电泳。

4. RNA反转录为cDNA。

5. cDNA与引物质量检测。

6. 利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况。

7. 定量 PCR检测。

8. 分析扩增曲线和溶解曲线。

三、服务说明及结果

1. 客户提供：样本。 

2. 公司提供：高质量的RNA、RNA电泳图、扩增曲线图、熔解曲线图、完整报告。

3. 实验周期：5-10个工作日。