10x Genomics 单细胞及免疫组库测序
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- 2023-08-10 15:19:48
上海欧易生物医学科技有限公司
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产品介绍
目前Chromium™单细胞V(D)J解决方案已升级,升级后的解决方案（Chromium Single Cell 5'Solution）一个样本可同时获得单细胞基因5'表达谱、T细胞受体和B细胞免疫球蛋白库的信息.可以结合基因的表达谱和V(D)J数据进行复杂组织样本的适应性免疫应答分析监测免疫疗法的效果，研究复杂的自身免疫性疾病、传染性疾病和其它免疫疾病。
图 | (D)J重组产生TCR/BCR多样性
技术优势
（1）可以拼接获得V(D)J区域全长信息；
（2）没有V-和J-特异性引物，避免了复杂的多重PCR的偏好性问题；
（3）在获得每个细胞V(D)J信息的同时，可以同时获得T细胞和B细胞的转录谱信息。
实验流程
Chromium Single Cell 5' Solution实验流程
Chromium Single Cell 5' Solution和Chromium Single Cell 3' Solution的主要区别在于凝胶珠上的引物序列有所不同
这种不同，使得Chromium Single Cell 3' Solution可以捕获mRNA的3' 端进行转录组测序
Chromium Single Cell 5' Solution可以捕获mRNA的5'端进行转录组测序并进行T细胞和B细胞的免疫组库测序
详细的5' cDNA建库及TCR/BCR V(D)J片段特异性扩增细节如下图所示
5' cDNA建库及TCR/BCR片段特异性扩增细节示意图
如上图所示，将cDNA一份为二（如果同时做TCR和BCR的话则为三），分别构建5' 基因表达文库和TCR（BCR）V(D)J文库。
5'单细胞表达谱和V(D)J免疫组库实验流程
上图是Chromium Single Cell 5' Solution的整体工作流程。加入样本产生单细胞油包水结构，反转录成cDNA后，选择不同的研究目的进行文库构建：5'基因表达文库、TCR的V(D)J文库或和BCR的V(D)J文库。
5' 单细胞表达谱和V(D)J免疫组文库比较
5' 单细胞表达谱和V(D)J免疫组测序参数比较
样本要求
（1）样品总量：制备成细胞悬浮液，一个样本的细胞起始量需大于1x10 5个；
（2）样品浓度：最终上样前细胞浓度在700 - 1,200 cells / μL；
（3）细胞活性：活细胞数目在85 %以上；
（4）细胞大小：直径小于40 μm；
（5）细胞培养基及缓冲液不能含有Ca 2+和Mg 2+等影响酶活性的物质；
（6）组织需解离成单细胞悬液
（7）提供细胞悬液中目标细胞（T细胞或B细胞）的数目比例
结果展示
克隆亚型丰度分析
Cell ranger软件对于TCR 应用 CDR3 区氨基酸序列进行克隆亚型分型，其有效barcode即为该亚型分型丰度，用于进行丰度分析。
克隆亚型丰度示例图
说明：横坐标为clonotype，纵坐标为细胞支持数（左图）或该clonotype所占总比例（右图）
V/J基因usage丰度分析
CDR3 V/J 区基因可反映出 TCR 克隆分型的特征。Loupe V(D)J Browser也可通过对Cell ranger软件单样本分析结果对V/J基因进行了丰度、聚类及V-J paired 分析，对 TRA/TRB,TRA+TRB 进行数据统计。
V/J基因usage丰度示例图
V/J paired circos图 V/J paired三维柱状图
CDR3特征分析
CDR3 氨基酸序列长度分布图 CDR3 V基因usage分布图
免疫组库聚类分析
可通过V或J基因在不同样本间表达量进行聚类分析，直接得到不同样本免疫组库特异性表达的基因及不同样本间免疫组库相似程度。
基因聚类图
