细胞实验
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- 2022-11-30 17:45:33
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1. 原代细胞制备与培养
将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，置于合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
原代细胞保留了很多来源组织的重要生理特性，能高度模仿体内的情况，且没有遗传和化学的改变。因此，原代细胞成为许多研究中理想的细胞模型。
原代细胞由于种类众多，分离方法各异，培养特性不一等因素，令许多细胞培养初学者望而却步，亿鸣复兴生物多年来致力于各类原代细胞的分离培养开发，目前已从大鼠、小鼠、人、兔、鸡等不同动物的不同部位成功分离了超过400多种原代细胞。
将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，置于合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
原代细胞保留了很多来源组织的重要生理特性，能高度模仿体内的情况，且没有遗传和化学的改变。因此，原代细胞成为许多研究中理想的细胞模型。
原代细胞由于种类众多，分离方法各异，培养特性不一等因素，令许多细胞培养初学者望而却步，亿鸣复兴生物多年来致力于各类原代细胞的分离培养开发，目前已从大鼠、小鼠、人、兔、鸡等不同动物的不同部位成功分离了超过400多种原代细胞。
2. 稳转细胞系的培养与筛选
稳定转染就是将外源基因DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因及蛋白。需要在瞬时转染基础上对靶细胞进行筛选或者应用高转染效率的病毒，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物进行细胞传代，从而得到可稳定表达目的基因的细胞系。
亿鸣复兴生物具有丰富的稳转细胞系构建经验，可为客户提供悬浮细胞/贴壁细胞的过表达/干扰基因多克隆/单克隆稳转细胞系构建服务。
稳定转染就是将外源基因DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因及蛋白。需要在瞬时转染基础上对靶细胞进行筛选或者应用高转染效率的病毒，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物进行细胞传代，从而得到可稳定表达目的基因的细胞系。
亿鸣复兴生物具有丰富的稳转细胞系构建经验，可为客户提供悬浮细胞/贴壁细胞的过表达/干扰基因多克隆/单克隆稳转细胞系构建服务。
3. MTT检测
MTT是3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2.5-diphenyl tetrazolium bromide的简称。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。然后采用二甲基亚砜(DMSO)溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
MTT是3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2.5-diphenyl tetrazolium bromide的简称。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。然后采用二甲基亚砜(DMSO)溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
4. 细胞划痕实验
细胞划痕实验是简洁测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似于体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或者其他硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后再继续培养细胞至实验设定时间，然后取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以判断细胞的生长迁移能力。
优势：按照客户要求，周期快，图片美观能达到发表论文水平
细胞划痕实验是简洁测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似于体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或者其他硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后再继续培养细胞至实验设定时间，然后取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以判断细胞的生长迁移能力。
优势：按照客户要求，周期快，图片美观能达到发表论文水平
5. 细胞克隆形成实验
克隆形成实验是肿瘤细胞学研究中的一种常用技术，其原理是将细胞分离成单细胞悬液，在培养基上接种培养，根据集落形成数量和大小来检测细胞增殖能力和致瘤性。该实验可用来研究肿瘤细胞的增殖能力、侵袭性，探讨细胞对不同杀伤因素的敏感性。
根据培养基是否需要软琼脂，克隆形成实验可以分为平板克隆形成实验（PCF）和软琼脂克隆形成实验（SACF）。PCF是直接将细胞接种于培养瓶、培养皿中，优点为操作简便、细胞间分泌的促生长因子可在培养液中扩散、克隆形成率高，适用于贴壁生长的细胞;缺点为细胞在 贴壁前易于移动。SACF 是采用半固体培养基模拟体内生长环境，适用于悬浮细胞及不依赖于贴壁生长的肿瘤细胞。在悬浮状态下不能增殖的细胞（如正常成纤维细胞）不适用此法。
克隆形成实验是肿瘤细胞学研究中的一种常用技术，其原理是将细胞分离成单细胞悬液，在培养基上接种培养，根据集落形成数量和大小来检测细胞增殖能力和致瘤性。该实验可用来研究肿瘤细胞的增殖能力、侵袭性，探讨细胞对不同杀伤因素的敏感性。
根据培养基是否需要软琼脂，克隆形成实验可以分为平板克隆形成实验（PCF）和软琼脂克隆形成实验（SACF）。PCF是直接将细胞接种于培养瓶、培养皿中，优点为操作简便、细胞间分泌的促生长因子可在培养液中扩散、克隆形成率高，适用于贴壁生长的细胞;缺点为细胞在 贴壁前易于移动。SACF 是采用半固体培养基模拟体内生长环境，适用于悬浮细胞及不依赖于贴壁生长的肿瘤细胞。在悬浮状态下不能增殖的细胞（如正常成纤维细胞）不适用此法。
6. Transwell迁移侵染
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。Transwell迁移实验常用8.0、12.0 µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
7. 双荧光素酶实验
荧光素酶报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测荧光素酶活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪（化学发光仪）测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。
双荧光素酶体系，即有两种荧光素酶，比较常见的组合是萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，萤火虫荧光素酶作用于甲虫荧光素，而海肾荧光素酶在氧的存在下作用于海肾荧光素。以其中一个作为内参对照，即表达量基本恒定，用于减少试验中不同处理间所固有的变化，包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率，而另外一个荧光素酶则作为报告基因，用于指示不同处理条件下基因的表达情况。
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。Transwell迁移实验常用8.0、12.0 µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
荧光素酶报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测荧光素酶活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪（化学发光仪）测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。
双荧光素酶体系，即有两种荧光素酶，比较常见的组合是萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，萤火虫荧光素酶作用于甲虫荧光素，而海肾荧光素酶在氧的存在下作用于海肾荧光素。以其中一个作为内参对照，即表达量基本恒定，用于减少试验中不同处理间所固有的变化，包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率，而另外一个荧光素酶则作为报告基因，用于指示不同处理条件下基因的表达情况。
8. 血管形成实验
血管形成体外模型可分为细胞水平的增殖实验、迁移实验和管腔形成实验，以及器官水平的人胎盘血管段培养模型和大鼠动脉环模型。目前通常所说的血管形成实验是指管腔形成实验。管腔形成反映毛细血管的早期过程，是体外检查内皮细胞功能最完整的指标。
血管形成过程中内皮细胞会形成细胞条索，然后形成管腔，体外在特定条件下如基质胶、胶原等培养时也能形成管腔。药物通过抑制管腔形成或使形成的管腔断裂来达到抑制血管形成的作用。借助计算机软件计算小管数及小管之间的连接数及小管的长度和面积，可定量分析药物对管腔形成的影响。
血管形成体外模型可分为细胞水平的增殖实验、迁移实验和管腔形成实验，以及器官水平的人胎盘血管段培养模型和大鼠动脉环模型。目前通常所说的血管形成实验是指管腔形成实验。管腔形成反映毛细血管的早期过程，是体外检查内皮细胞功能最完整的指标。
血管形成过程中内皮细胞会形成细胞条索，然后形成管腔，体外在特定条件下如基质胶、胶原等培养时也能形成管腔。药物通过抑制管腔形成或使形成的管腔断裂来达到抑制血管形成的作用。借助计算机软件计算小管数及小管之间的连接数及小管的长度和面积，可定量分析药物对管腔形成的影响。
9. 酶活检测
酶活性测定法是利用酶能专一而高效地催化化学反应的性质，通过测定酶促反应速度来检知体液等生物样品中某种酶的含量和活性的分析技术。
取样法：是在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当方法停止其反应，再根据产物和底物在化学性质上的差别进行分析，求得单位时间内酶促反应的变化量。
连续法：则是基于底物和产物在物理化学性质上的不同，在反应过程中对反应系统添加酶的变性剂以终止反应。根据产物和底物在某一波长或波段上有明显的特征吸收差别而建立起来的连续观测方法。
终点法：该方式是在特定条件下，将样品中要检知的酶作用一定量的底物，然后根据反应进行到某一程度所需要的时间长短来估计酶的活力。其一个发展是采用检测器对反应进行连续跟踪，并在反应达到某一程度时，精确地自动记录所需要的时间，这就是酶分析自动化中的固定浓度法;另一个发展是作成简便的酶检测纸片。
动力学法：该方式测定原理是在一定条件下，酶促反应速度和酶浓度成正比，因此测得反应速度就需要求得酶浓度。待测的酶浓度是影响反应速度的唯一因素，其他因素都应处于最适于酶发挥催化作用的水平，为此应选择适宜的底物浓度、缓冲体系、温度，并向反应系统中添加必要的辅助因子。
酶活性测定法是利用酶能专一而高效地催化化学反应的性质，通过测定酶促反应速度来检知体液等生物样品中某种酶的含量和活性的分析技术。
取样法：是在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当方法停止其反应，再根据产物和底物在化学性质上的差别进行分析，求得单位时间内酶促反应的变化量。
连续法：则是基于底物和产物在物理化学性质上的不同，在反应过程中对反应系统添加酶的变性剂以终止反应。根据产物和底物在某一波长或波段上有明显的特征吸收差别而建立起来的连续观测方法。
终点法：该方式是在特定条件下，将样品中要检知的酶作用一定量的底物，然后根据反应进行到某一程度所需要的时间长短来估计酶的活力。其一个发展是采用检测器对反应进行连续跟踪，并在反应达到某一程度时，精确地自动记录所需要的时间，这就是酶分析自动化中的固定浓度法;另一个发展是作成简便的酶检测纸片。
动力学法：该方式测定原理是在一定条件下，酶促反应速度和酶浓度成正比，因此测得反应速度就需要求得酶浓度。待测的酶浓度是影响反应速度的唯一因素，其他因素都应处于最适于酶发挥催化作用的水平，为此应选择适宜的底物浓度、缓冲体系、温度，并向反应系统中添加必要的辅助因子。
