SiMax II质粒DNA小量提取试剂盒使用说明

概 述

本实验方法的基本原理是，在高盐状态下，硅胶膜专一性地吸附DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。此法简便快捷，可在30分钟内同时提纯二十多个样品。从3～5ml培养过夜的含高拷贝质粒的菌液中可以获得10～20µg高纯度的质粒DNA，用于酶切、转化、DNA自动测序和手工测序等。
 

试剂盒包装及组成

                                50次

1. 悬浮液(溶液I)         7ml
2. 裂解液(溶液II)        10ml
3. 中和液(溶液III)       10ml
4. 结合液                     25ml
5. 洗脱液                     2.5ml
6. 离心纯化柱B           50套
7. 产品说明书             1份

实验前注意事项

※溶液I最好于4℃保存，使用前移至室温，待试剂温度达到室温后再使用；其它试剂于室温保存。
※室温低于25℃时，溶液可能出现结晶或盐析，此时请务必预热，使其完全溶解后使用。

用户自备的仪器及试剂

1. 台式高速离心机
2. 1.5ml或2ml林习惯及离心管架
3. 100ul、1000ul移液器及吸头
4. 80%异丙醇或80%乙醇 

操作方法

1. 将3～5ml菌液13,000rpm离心30秒收集沉淀（菌体）。
如果用1.5ml或2ml离心管则需反复离心2～3次。
2. 倒掉上清，将沉淀（菌体）完全悬浮于100µl悬浮液(溶液I)中。
上清要尽可能去除干净，可用滤纸吸干。沉淀要用混旋器完全悬浮，否则将直接导致下一步的裂解不彻底，进而影响质粒DNA的产量和纯度。
3. 加入150µl裂解液(溶液II)，轻柔地颠倒混匀10次左右，溶液逐渐变得
粘稠、清亮。
不可用混旋器剧烈振荡，否则会使质粒DNA断裂；裂解时间不宜超过5分钟，否则会造成染色体DNA的污染。
4. 加入150µl中和液(溶液III)，轻柔地颠倒混匀10次左右。
此时可见到白色絮状的染色体DNA及细菌碎片。
5. 13,000 rpm离心8～10分钟，将上清液小心转移入一个新的1.5ml离心管中，加入等体积(约400µl)的结合液，颠倒混匀。
6. 将混和液吸入离心纯化柱中，静置至少3分钟，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。
   此步使处于高盐状态下的质粒DNA与硅胶膜结合后，离心去除杂质。
7. 将纯化柱重新套入废液收集管中，加入600µl 80%异丙醇(或80%乙醇)，13,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
如果纯化柱底部残留有异丙醇（或乙醇），可用滤纸吸干，否则将影响以后的酶促反应。此步是洗涤质粒DNA中混有的杂质及盐类。
8. 重复第7步一次，尽可能将杂质及残留的异丙醇或乙醇去除。
9. 取出纯化柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管，开盖放置2~3分钟，使乙醇充分挥发干净。加入50µl 洗脱液（若用于测序，则加50µl超纯水）于硅胶膜上，不能粘在管壁上。室温下放置5分钟后，13,000rpm离心1分钟。
     离心柱放入离心管中，若盖不上盖子，亦没有关系，可开盖离心。洗脱液或无菌超纯水的用量视用户对浓度的要求而定，但超纯水的洗脱效率不如专门的洗脱液。
10. 将洗脱液重新吸入纯化柱中，再洗脱一次。这样可以获得较高产量的质粒DNA。
11. 离心管中收集的液体即是洗脱下来的质粒DNA，取1～2µl电泳（0.8%琼脂糖，120V，15～20分钟）检测其纯度并目测定量。
若发现有RNA污染，可加入0.5µl RNaseA (10mg/ml)，37℃保温30分钟。此操作不影响其后续实验。

补充说明

※如果起始菌液体积较大或收集的菌体较多，溶液I、II、III的用量及其它试剂可相应放大。但操作略有不同，需要时我们乐于提供帮助。
※实验证明，少量的RNA污染对于酶切、转化及测序无明显的影响。
 
 
常见问题及参考意见