货号：05-200-1A 基础培养基，05-200/201Kit(05-200-1A+05-201-1U)（基础培养基+营养添加物）
规格：500ml/瓶，100ml/瓶（基础培养基）；3ml/瓶，0.6ml/瓶（基础添加物）

产品说明书：

一、目的：利用间充质干细胞无血清培养基培养分离脐带间充质干细胞。

二、材料：新生儿脐带

三、主要仪器：医用手术器械，生物安全柜，CO₂培养箱，6孔培养板，T25培养瓶

四、试剂：

表1 MSC NutriStem^® XF Medium

用途	品牌	货号	名称	规格	保存条件
MSC培养基	Biological Industries	05-200-1A	MSC NutriStem® XF Basal Medium MSC无血清基础培养基	500ml	4℃
	Biological Industries	05-201-1U	MSC NutriStem® XF Supplement MSC无血清添加剂	3ml	-20℃
细胞贴壁	Biological Industries	05-752-1H	MSC Attachment solution (100X) MSC贴壁试剂	1 ml	4℃
	Biological Industries	PLTGOLD010R	PLTGold® Human Platelet Lysate 血小板裂解物**	10ml	-20℃
	**已知血小板裂解物含有大量的外泌体，用户可依照实验目的选用合适的贴壁试剂。
细胞传代	Biological Industries	03-079-1A	Recombinant Trypsin-EDTA Solution 重组胰酶-EDTA	500ml	RT
	Biological Industries	03-048-1C	Soybean Trypsin Inhibitor (50X) 大豆胰酶抑制剂	20 ml	-20℃
	Biological Industries	C3590-0500	DPBS (w/o Ca & Mg)	500 ml	RT
			DPBS缓冲液
辅助试剂	Biological Industries	05-713-1B	NutriFreez®  D10 Cryopreservation Medium	100 ml	4℃
			D10 冻存液
	Biological Industries	C3420-0100	Penicillin-Streptomycin Solution (100X)青链双抗	100ml	-20℃
	VivaCell	C3501-0010	MSC ACF Tissue Digestive Mix 高效原代干细胞分离液	100m	-20℃

五、实验前准备：

5.1完全培养基的准备

5.1.1冻存的MSC NutriStem^® XF Supplement在室温或2-8℃解冻，避免反复冻融。

5.1.2配制：MSC NutriStem^® XF Basal Medium（培养基）：MSC NutriStem^® XF Supplement（添加物）：青链双抗=500ml：3ml：5ml，4℃保存，2周内使用。

注1：双抗非必须，建议原代（P0）时使用。

注2：培养基含L-Glutamine，贮藏时避免长期照光。

 

5.2包被培养皿

或跳过此步骤，直接加2%血小板裂解物，促进MSC细胞贴壁与生长。

如果使用05-752-1H，参考如下步骤：

5.2.1使用DPBS溶液（BI, Cat# 02-023-1A），将MSC贴壁试剂稀释100倍（1:100）。

5.2.2参照表3，加入适量的1X MSC贴壁试剂涂层培养皿或板。

表3  涂层过程中贴壁试剂建议使用量（05-752-1）

 

培养器皿	表面积cm2/孔或瓶	1X MSC贴壁试剂使用体积
96孔板	0.34	0.05~0.1 ml
24孔板	1.9	0.2~0.4 ml
12孔板	3.9	0.4~0.8 ml
6孔板/ 35 cm培养皿	9.6	1~2 ml
T25瓶/ 60 cm培养皿	25	2.5~5 ml
T75瓶	75	7.5~15 ml

 

注1：涂层的培养皿需在无菌条件下2℃-8℃储存，需在一周内使用。（标示红色为原厂建议使用量，经过实验测试后可减半使用）

注2：包被期间， 注意包被液不可以干掉！

 

5.2.3轻轻摇动培养皿，确认贴壁试剂均匀分布在培养皿表面后，用封口膜包裹涂层的培养皿。

5.2.4在2-8℃孵育过夜；或者在CO₂培养箱，37℃，至少孵育30分钟。

5.2.5接种前, 吸除贴壁试剂，再用DPBS轻轻冲洗培养皿，即可接种细胞。

 

 

如果使用05-760-1-15，参考如下步骤：

5.2.1使用生理盐水，将NutriCoat™ 促贴壁试剂稀释500倍（1:500）。

5.2.2参照表4，加入适量的1X NutriCoat™ 促贴壁试剂涂层培养皿或板。

表4  涂层过程中贴壁试剂建议使用量（05-760-1-15）

培养器皿	表面积cm2/孔或瓶	1X NutriCoat™ 促贴壁试剂使用体积
96孔板	0.34	0.1 ml
24孔板	1.9	0.5 ml
12孔板	3.9	1 ml
6孔板	9.6	2.5 ml
T25瓶	25	6.5 ml
T75瓶	75	19 ml

注1：涂层的培养皿需在无菌条件下2℃-8℃储存，需在一周内使用。

注2：包被期间，注意包被液不可以干掉！

5.2.3轻轻摇动培养皿，确认贴壁试剂均匀分布在培养皿表面后，用封口膜包裹涂层的培养皿。

5.2.4在2-8℃孵育过夜；或者在CO₂培养箱，37℃，至少孵育1小时。

5.2.5接种前, 吸除贴壁试剂，用DPBS轻轻冲洗培养皿（或不需要清洗），即可接种细胞。

 

5.3制备1X大豆胰酶抑制剂

5.3.1使用无菌的DPBS，将50X大豆胰酶抑制剂（03-048-1C）稀释成1X。

注1：抑制重组胰酶消化建议方法：第一种使用大豆胰酶抑制剂；第二种使用PBS/DPBS清洗（2倍重组胰酶量）吹打, 离心去上清；第三种使用维持培养基抑制。

 

六、使用范例：

6.1 UC-MSC原代培养 （组织块法）

6.1.1无菌条件下取新鲜脐带，用DPBS漂洗净血迹

注1： 一般脐带取得非无菌环境，可以稍微用75%酒精润洗。

6.1.2置10cm 培养皿中，剪成1~2cm脐段，剔除血管，用DPBS洗净血迹，再剪成1mm³组织块。(图 1)

6.1.3用无菌滴管吸取少量细小组织块均匀散布在 6 孔板 2 个孔中。

6.1.4 37℃，5%CO₂培养箱孵育 30min，以使组织块粘贴在培养皿壁上。

6.1.5 向每孔滴加0.8ml 完全培养基 (注意沿孔壁小心滴加，勿使冲动组织块)。

6.1.6 37℃，5% CO₂ 培养箱孵育过夜，次日 (D1) 每孔再补加1ml 完全培养基。

6.1.7 37℃，5% CO₂ 继续培养，5天 (D6) 后半量换液 (此时一般看不到细胞，但最快3天就可看到细胞从组织边沿爬出)。

6.1.8再过5天后半量换液 (此时一般会有细胞爬出，但最晚可到14天会出现细胞从组织边沿爬出) (图2、图3)。

6.1.9每2天换一次培养液，继续培养2~4天，待细胞融合度（Confluency）达到约80%后传代培养(图4)。

注1：组织块培养的关键是要保障组织块始终贴壁，换液动作要尽可能轻微，避免冲动组织块。培养基加量不能太多，以免组织块漂浮。

注2：为增加成功率，从原代分离脐带和脂肪间充质干细胞,培养基可加2.0 % PLTGold® 血小板裂解物。

 

6.2 UC-MSC原代培养 （消化法）

MSC NutriStem^® 无血清培养基也能有效地培养消化法取得的原代细胞，操做方式如下：

6.2.1 将脐带用DPBS漂洗干净，剪成1-50px,后剔除血管。

注1：一般脐带取得非无菌环境，可以稍微用75%酒精润洗。

6.2.2将组织剪成3-5mm³后，移入50ml离心管，再加入的分离液。

注1：一条长度10公分的脐带建议加入10ml的分离液；或者组织块 : 分离液（vol）= 1:1。

注2： 视情况而定，可自行在分离液中添加1%青链双抗（BI, Cat# 03-031-1B）。

6.2.3把50ml离心管横放在37度细胞培养箱，过夜反应（16小时）。

注1：若总反应体积较大，也可持续旋转混合。

6.2.4加入和分离液等体积的0.05%EDTA（BI, Cat#03-015-1B）终止反应后，1500 xg离心5分钟，去除上清。

注1：溶液比较浓稠，小心不要影响下层的细胞;建议留下5ml左右的溶液。

注2： 若是脂肪组织，没有粘稠的情形，以常规的200-300 xg离心即可。

注3：没有EDTA, 可使用无钙镁DPBS取代；此时建议后面步骤6多重复2-3次，以确实去除酵素。

6.2.5以和分离液等体积的无钙镁DPBS重悬细胞后，500 xg离心5分钟，去除上清。

6.2.6再次以和分离液等体积的无钙镁DPBS重悬细胞后，250 xg离心5分钟，去除上清。

6.2.7用适量的培养基重悬细胞后，即可按常规细胞培养方法接种P0代细胞培养。

注1：消化后的原代细胞，建议培养时接种密度提高到10,000/cm²以上；传代后即可按常规的接种密度培养。

 

6.3 UC-MSC传代培养与冻存

6.3.1待细胞融和度达到约80%后进行传代（细胞不能太密集，否则容易分化），吸弃传代板孔中的培养基，每孔加适量DPBS轻轻冲洗1次。

6.3.2根据培养皿适量加入重组胰酶-EDTA（货号：03-079-1A，T25建议使用1ml），在37℃，5% CO₂培养箱作用3~5 min（可轻拍培养瓶帮助细胞脱落）。

6.3.3显微镜下观察细胞完全脱落后，使用5-10ml稀释大豆胰酶抑制剂（SBTI, 货号：03-048-1，1X），1000rpm离心3~5min。

6.3.4谨慎吸出上清，细胞团块用适当体积的完全培养基悬浮后，混匀细胞悬液。

6.3.5按照所需的比例进行传代或按照5000-6000cells/cm²的细胞密度将细胞接种至培养器皿中，放入37℃, 5% CO₂培养箱内培养。

6.3.6每2-3天更换一次培养基，待细胞融合度达到80%左右时，参照操作步骤6.3.1~6.3.5做细胞传代；或者参照操作步骤6.3.1~6.3.3收获细胞冻存。

6.3.7细胞冻存：将细胞团块悬浮于适量 (0.5~1×10⁶cells/ml) D10无血清 冻存液（货号：05-713-1）中，装入冻存管，2~8℃冰箱放置30min，-80℃冰箱放置 24h，转入液氮罐冻存。

注1：本方法仅供参考，用户可根据自身经验做合理调整。

附图：（如下是组织块法，建议客户可以尝试消化法）

        

 图1剔除脐带3根动静脉血管            图2细胞从组织块边沿爬出

         

图3细胞快速增殖                            图4传代时机成熟