乙酰化蛋白快速检测和定量

用乙酰化抗体填料及HRP标记乙酰化抗体快速检测和定量细胞总乙酰化蛋白

一、IP-ELISA联合方法原理及流程：

方法原理及流程说明：

1） 从实验组和对照组组的细胞中分别取400微克粗蛋白，每组用10uL抗乙酰化抗体琼脂糖填料富集（IP）。

2） 结合于琼脂糖填料上的的乙酰化蛋白每次用100微升0.1 M HCl，洗脱两次。

3） 将洗脱液汇集在一起，用饱和碳酸钠调节pH值至中性。

4） 然后取洗脱液100微升/孔包被于酶标板上，重复包被两孔，在室温下培养过夜。

5） 第二天用PBSt清洗板孔2次，用0.1%BSA inPBSt封闭板孔，孵育30分钟，再用PBSt洗涤三次。

5） 在37℃下添加HRP标记的抗乙酰化抗体（用0.1%BSA in PBSt稀释到0.25 ug/mL）30分钟。

6） 用PBSt清洗板孔4次，每孔加100微升TMB，培养30分钟显色。

7）每孔10 uL 2M 硫酸终止显色。在450 nm处读取吸光度。

8） 通过OD（处理）/OD（未处理）计算反应性乙酰化蛋白水平。

实例1：分析用不同浓度的TSA处理12小时的细胞中的总乙酰化蛋白水平。即先用抗AcK琼脂糖填料IP,再以ELISA方法用HRP标记的抗乙酰化抗体做检测不同浓度TSA处理的细胞中，快速检测出其蛋白质乙酰化增加达10倍。

二、IP-WB联合方法高确定性检测乙酰化蛋白

实例2：分别用HDAC抑制剂TSA处理5和15小时后，对MMRU细胞样品中的乙酰化蛋白质进行Western blot分析。即样品先用抗乙酰化赖氨酸琼脂糖亲和富集（IP），再用WB方法，加入HRP标记的抗乙酰化抗体进行检测，快速得到高确定性的WB结果。

三、快速检测乙酰化蛋白所用到的相关抗体试剂