PNAS | 双重测序技术通过对DNA双链的独立测序极大提高测序精度，可直接定量体内诱变和致癌作用
当前，二代测序技术（NGS）在基因测序深度和精度方面取得了长足的发展，为精准医学的发展提供了重要的工具支持。但用NGS直接从提取的DNA中检测极其罕见的体细胞突变，同时不受基因组位点、组织或生物体的限制，却很难实现。并且标准NGS的技术误差率远远高于正常组织中每个核苷酸突变的真实频率 。
双重测序（Duplex Sequencing）是随着二代测序技术的发展而诞生的，它是对DNA的双链分别进行独立的标记和测序，然后比对两条链中每一段的序列，并排除分析中的不匹配位点（人为错误），能够以极高的敏感性和特异性识别真实突变，把测序精度推向更高水平。
近日，基因测序公司TwinStrand Biosciences联合毒理学检测机构中心的研究人员，测试了用双重测序测定体内遗传毒物作用的可行性。研究证明了双重测序是一种极其准确的纠正NGS（ecNGS）技术，是遗传毒理学领域的一种强有力的工具，可用于评估体内诱变和致癌作用。与现有方法相比，ecNGS具有更快的速度、更高的可扩展性、更丰富的数据输出以及跨物种和跨位点的适用性，使其成为突变研究、监管安全测试和新兴临床应用的强大新工具。该研究已发表在PNAS期刊上，文章题为“Direct quantification of in vivo mutagenesis and carcinogenesis using duplex sequencing”。
文章发表在PNAS上
研究内容及结果
为了评估DS是否可以量化体内诱变和致癌作用，研究人员设计了两组老鼠实验，包括两种转基因小鼠品系：一种常用于转基因啮齿动物（TGR）诱变试验，另一种常用于致癌性研究。并用三种不同的诱变致癌物处理两种小鼠的DNA，每种致癌物都有不同的作用模式，并检查了五种不同的组织类型，总共产生了近100亿个错误校正核苷酸的数据。
图1. 研究概要图。来源：PNAS
目前，转基因啮齿动物（TGR）检测是最有效的体内诱变测量方法，能够测量一个试验品在一个可选择的报告基因中产生突变的潜力。研究人员将双重测序测定的突变频率与通过TGR金标准检测得到的突变频率进行比较，结果发现DS产生的结果与转基因啮齿动物试验相当，并且由DS在VC样品中测得的突变频率比标准NGS的平均技术误差率低10,000倍。
图2. DS和TGR检测的比较。来源：PNAS
TGR的检测方法依赖于一个特定的转基因报告区，虽然通过这种方法很容易识别报告基因中的一部分突变，但对于其它突变的功能类别识别还存在一定的限制。随着人们对更复杂的多核苷酸突变谱的兴趣日益增加，每个碱基的功能评分变得至关重要。因此，研究人员经实验发现，DS能够摆脱这种限制，因为提取DNA后没有选择，所有可能的单核苷酸变异体、多核苷酸变异体和内含子都可以被识别，并且DS能够检测到整个基因长度（包括末端区域）的所有功能类别的突变。
图3. DS识别所有cII突变的功能类别。来源：PNAS
随后，研究人员还探索了传统检测方法无法获得的数据类型，包括突变谱、三核苷酸突变特征和突变功能预测效应。首先通过碱基取代的三核苷酸模式确定了每种诱变剂的特异性突变谱，突变谱显示出独特的突变模式，并且与人类癌症的模式相关。在易患癌症的小鼠品系中研究人员发现了一种致癌的原始标记，这可以通过携带激活癌基因的细胞在接触致癌物不到一个月后的克隆扩增来证明。这些发现表明，DS是一种强有力的方法，可以灵敏地检测和表征突变和致癌作用的早期克隆进化特征。
图4. 不同诱变剂处理的三核苷酸碱基取代谱反映了不同的突变过程。来源：PNAS
此外，研究者还观察到不同基因组区域和不同DNA链的突变敏感性的差异，这种差异可能是由于损伤或局部染色质结构的转录水平和转录偶联修复（TCR）的不同影响。为了进一步研究TCR对观察到的突变区域敏感性差异的潜在作用，对DS识别的每个位点的突变排列进行检查。结果表明在氨基甲酸乙酯暴露的组织中，Ctnnb1和Polr1c基因出现了突变链偏倚，这与TCR模型一致。
图5. 碱基取代的链偏倚存在于转录的中高水平区域。来源：PNAS
结 语
与传统的体内突变检测不同，双重测序不依赖于特定报告基因的选择，而是从感兴趣的DNA区域直接提取数十亿个单个核苷酸进行无偏移计数。与现有的工具相比，这产生了比当前工具更丰富、更广泛的基因组数据，将有助于解决更多的生物学问题。
参考文献
Short, N.J., Kantarjian, H., Kanagal-Shamanna, R. et al. Ultra-accurate Duplex Sequencing for the assessment of pretreatment ABL1 kinase domain mutations in Ph+ ALL. Blood Cancer J. 10, 61 (2020). https://doi.org/10.1038/s41408-020-0329-y
咨询
我们尊重知识产权，如您认为本平台所载文章、图片、视频等内容侵犯您的合法权益，请您及时联系我们，我们将依据相关法律法规、平台规则予以处理。
关键字
- 93
- 点赞
- 复制链接
- 举报
