Nature Medicine| 单细胞转录测序分析与临床试验相结合，发现多发性骨髓瘤新的耐药分子途径
背 景 介 绍
多发性骨髓瘤是一种浆细胞恶性肿瘤，表现为骨髓内恶性浆细胞（PCs）的扩张，进而导致主要器官功能破坏。目前，多发性骨髓瘤仍然是一种无法治愈的恶性肿瘤，大多数患者会复发并死于该病。
尽管目前新的抗骨髓瘤药物的引入大大改善了骨髓瘤患者的预后情况，但仍有相当一部分患者治疗后存在耐药性以及前期治疗后的早期复发，这与不良预后和生存期降低密切相关。这些原发性难治性骨髓瘤患者在临床试验中代表性不足，因此并没有建立合适的治疗策略来管理他们，因此，探索这些患者相关的异质性和用药途径的试验有助于发现新的靶向药物。
同时，当前关于多发性骨髓瘤疾病的描述缺乏深度、分辨率和准确性，无法从分子水平定义恶性细胞和驱动残留疾病进展、耐药性和复发的途径。肿瘤细胞和微环境的适应以及不断进化的特征使得开发新的方案来进行风险分层和预测患者的预后是必要的，这将会极大地优化治疗管理。因此，临床上迫切需要新的治疗策略和分子生物标志物，以实现更有效的患者分层和临床护理。
近日，来自以色列特拉维夫大学萨克勒医学院、魏茨曼研究所等单位的研究人员在Nature Medicine在线发表了题为“Identification of resistance pathways and therapeutic targets in relapsed multiple myeloma patients through single-cell sequencing”的文章。该研究通过对多发性骨髓瘤进行前瞻性、多中心、单臂临床试验，并结合单细胞转录组测序分析，对患者产生耐药的分子机制进行了动态追踪，并发现了包括缺氧耐受、蛋白质折叠和线粒体呼吸在内的新的耐药分子途径。
文章发表在Nature Medicine
主 要 内 容
研究队列及总体转录组特征
该研究共纳入了41例原发性难治性和早期复发的多发性骨髓瘤患者，这些患者在硼替佐米诱导治疗方案后要么没有反应，要么经历了早期复发；除此之外，还包括11名健康受试者和15名新诊断的多发性骨髓瘤患者。通过设置严格的对照并进行深度对比分析，以期发现新的耐药途径。
借助MetaCell算法，研究人员从单细胞转录组数据中识别出不同状态的细胞群，在分析这些患者治疗前后的单细胞转录组数据时，研究人员发现，尽管每个患者都表现出独特的转录特征，但他们通常都有高表达的驱动基因，如CCND1、CCND2和FRZB27。
研究人员还在大多数患者中发现了一小部分看似健康的多克隆浆细胞，这些细胞在原发性难治性患者队列中有更高的可变性。不过，尽管这些分析明确了初诊多发性骨髓瘤和原发性难治性多发性骨髓瘤患者恶性浆细胞的分子特征和驱动基因，但两组之间并没有显著差异，也就是说，治疗耐药的多发性骨髓瘤患者内部和之间的疾病异质性并不明显。
图1. 纳入研究人群的总体转录组特征，来源：Nature Medicine
难治性和耐药多发性骨髓瘤患者具有独特的应激通路
为了明确难治性和耐药多发性骨髓瘤患者的分子基础，研究人员使用Bootstrapping的方法量化特定克隆的多发性骨髓瘤细胞和健康对照组之间的表达。在对错误率进行矫正之后，他们发现了66个差异表达基因，这些基因可以将新诊断的患者与难治性患者的恶性浆细胞区分开来，其中包括一些先前描述的多发性骨髓瘤高危因素相关基因，如STMN1、PSMB4、RRM2和TYMS28-32，以及与多发性骨髓瘤高危因素无关的新基因，如PPIA。
上述分析提示，难治性和耐药多发性骨髓瘤患者具有独特的应激通路，这些耐药特征包括线粒体应激基因，蛋白质折叠相关通路，以及蛋白酶体机制。
图2. 耐药机制的鉴定，来源：Nature Medicine
多发性骨髓瘤患者治疗反应的纵向单细胞克隆动力学
在该临床试验进行过程中，有几个患者在最初治疗时有效果，但后来却复发了。克隆进化是肿瘤耐药和进展的主要驱动力。为了解决这个重要的问题，研究人员对部分缓解的多发性骨髓瘤患者治疗前后的浆细胞进行了纵向单细胞分析和克隆分析。
通过对患者的转录克隆动力学分析，他们确定了三种主要的克隆轨迹：对治疗有反应的克隆 （敏感克隆）；对治疗没有反应或只有部分反应的克隆（耐药克隆）；和选择性耐受克隆，这些结果与患者的临床反应一致。
从原始克隆到新兴抗性克隆表现出一致下调的基因之一是CD38。此前的研究也表明，在治疗后CD38会下调。除此之外，他们还观察到与髓细胞相关的基因上调，如S100A10和S100A11。这些转录克隆是在治疗后出现的，这表明获得治疗耐药可能发生在多个阶段。这些分析表明，动态单细胞分析是一种重要的分子显微镜，可以动态定义患者对治疗的反应，以及与肿瘤耐药相关的基因和通路。
图3. 多发性骨髓瘤患者克隆演化的轨迹鉴定，来源：Nature Medicine
PPIA是多发性骨髓瘤患者耐药机制广泛的新靶点
研究人员还发现肽酰丙酰异构酶A（PPIA），一种蛋白质折叠反应通路的中心酶，可以作为耐药多发性骨髓瘤潜在的新靶点。单细胞转录组比较分析发现PPIA在复发难治多发性骨髓瘤和治疗无应答患者中均高表达，表明PPIA是一个潜在的多发性骨髓瘤耐药基因。
为了验证PPIA在多发性骨髓瘤患者耐药中的作用，研究人员利用CRISPR-Cas9技术敲除PPIA或用小分子抑制剂环孢素抑制PPIA，发现这些操作能使多发性骨髓瘤肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂显著增敏。
图4. PPIA在多发性骨髓瘤肿瘤细胞耐药中的作用，来源：Nature Medicine
研究总结
综上所述，该研究显示了将纵向单细胞测序分析与临床试验相结合的潜力，两者结合可以准确定义与应答性和耐药患者相关的分子途径。基于此，该研究定义了多项与多发性骨髓瘤患者耐药相关的机制，包括蛋白酶体机制、线粒体应激、内质网应激和蛋白质折叠通路，表明一些耐药特征基因在复发难治多发性骨髓瘤患者耐药机制中起因果作用，并且可以被作为新的潜在用药靶点，如PPIA。另外，将临床试验数据与单细胞研究分析相结合时，研究人员发现原发性难治性多发性骨髓瘤患者的特征可以预测联合治疗的临床反应及预后。
总之，该研究为单细胞转录组图谱与临床试验的结合提供了典范，也证明了两者的结合具有重要的临床意义，这样的研究将有助于设计分子诊断、个性化治疗选择和鉴定治疗耐药患者的新靶点。
参考文献
1. Cohen, Y.C., Zada, M., Wang, SY. et al. Identification of resistance pathways and therapeutic targets in relapsed multiple myeloma patients through single-cell sequencing. Nat Med (2021).
2. Palumbo, A. & Anderson, K. Multiple myeloma. N. Engl. J. Med. (2011).
3. Corre, J. et al. Early relapse after autologous transplant for myeloma is associated with poor survival regardless of cytogenetic risk. Haematologica. (2019).
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