rBSA Promoter在免疫检测试剂中的应用研究

rBSA Promoter在免疫检测试剂中的应用研究

    在免疫诊断试剂的反应体系中，抗原抗体反应时所处的微环境对免疫检测试剂的性能有重要影响，其中反应体系的伴随蛋白是影响分析方法特异性、灵敏度的关键因素之一。传统的广泛应用的伴随蛋白是天然牛血清白蛋白（BSA），但由于天然的BSA含有较多非极性氨基酸，具有很强的疏水键形成能力，所以，容易和样本中的杂质、 capture蛋白、detection蛋白形成非特异性吸附，从而产生较高的本底信号，严重降低了检测方法的信噪比（SNR）。为了降低本底信号，研究者们有时用小牛血情、山羊血清代替BSA，或者添加各种表面活性剂，但这些操作在降低本底的同时，也不同程度地降低了真阳性的响应信号值，并不能有效提升免疫检测试剂的性能。免疫诊断试剂的研究者们一直在努力寻找一种既能有效降低本底，又能增强抗原抗体反应强度的伴随蛋白，直到rBSA Promoter的出现，人们终于找到了有效解决这一矛盾的方法。

rBSA Promoter是一种重组蛋白，专为免疫检测技术而设计，是对BSA的重组改造，其极性亲水性氨基酸占比高达95%，而氨基酸组成及蛋白结构的改变，使含有rBSA Promoter的免疫检测体系在降低本底的同时，有效促进抗原抗体的结合反应，显著增大信噪比，提高免疫检测试剂的质量。

• 抗原抗体结合原理

根据大学课本上的知识描述，抗原抗体的结合力，有以下四种：

   1、氢键作用

   2、疏水键作用

   3、离子键作用

   4、范德华力作用

二、rBSA Promoter设计原理

    范德华力是个什么鬼东西，一直没有搞明白。而rBSA Promoter的设计原理如下：

   1、协助抗原抗体形成氢键

   2、封闭固相化蛋白的疏水基团

三、rBSA Promoter的特点

1、显著提升抗原抗体的结合能力

2、显著降低本底噪音信号

3、和BSA相比，具有更好的稳定抗原抗体的能力

4、兼顾绝大多数抗体抗原蛋白的反应特点

四、rBSA Promoter的应用CASE

（一）间接法检测人血清中抗VEGF抗体（ACL化学发光平台）

1、试剂材料

（1）SA-磁珠

（2）生物素化VEGF抗原

（3）鼠抗人IgG-ABEI示踪物

（4）空白人血清

（5）抗VEGF标准品:0.05ng/ml  2ng/ml

2、仪器：全自动分子发光生物免疫分析仪（rightflare60pro）

3、方法与过程

（1）分别用1%BSA和rBSA promoter工作液作为反应buffer，用两种buffer各自稀释SA磁珠、VEGF-biotin、鼠抗人IgG-ABEI、样本，上机测试。

（2）反应流程：

1）SA-磁珠+样本+VEGF-biotin，反应10分钟

2）洗涤

3）加鼠抗人IgG-ABEI，反应5分钟

4）洗涤

5）读发光值

4、结果

 

 

Indicator	1%BSAsystem (RLU)	rBSA Promoter(RLU)
Blank(normal serum mixture）	850	350
Individual1	760	346
Individual2	989	342
Individual3	1006	319
0.05ng/ml pos S/blank	848 0.99	702 2.00
2ng/ml pos S/blank	16115 18.95	29008 82.88

5、小结

（1）在亲和素生物素参与的间接法检测人血样本实验中，rBSA Promoter能高效去除人血中正常IgG的非特异性吸附，显著降低本底噪音。

（2）rBSA Promoter能显著促进抗原抗体反应，增加阳性响应值，提高信噪比。

（二）间接法检测人血清中抗PD1抗体（ACL化学发光平台）

1、试剂材料

（1）SA-磁珠

（2）生物素化PD1抗原：PD1-biotin

（3）鼠抗人IgG-ABEI示踪物

（4）空白人血清

（5）抗PD1标准品：0.1ng/ml；0.2ng/ml；0.4 ng/ml； 400 ng/ml； 800 ng/ml。

2、仪器：全自动分子发光生物免疫分析仪（rightflare60pro）

3、方法与过程

（1）分别用1%BSA和rBSA promoter工作液作为反应buffer，用两种buffer各自稀释SA磁珠、PD1-biotin、鼠抗人IgG-ABEI、样本，上机测试。

（2）反应流程：

1）SA-磁珠+样本+PD1-biotin，反应10分钟

2）洗涤

3）加鼠抗人IgG-ABEI，反应5分钟

4）洗涤

5）读发光值

4、结果

 

Indicator	1%BSAsystem(RLU)	rBSA Promoter(RLU)
Blank(normal serum mixture）	1040	485
0.1ng/ml pos S/blank	1041 1.00	765 1.57
0.2ng/ml pos S/blank	1146 1.10	1148 2.36
0.4ng/ml pos S/blank	1385 1.33	2123 4.37
400ng/ml pos S/blank	64000 61.53	160000 329.89
800ng/ml pos S/blank	110600 106.34	289000 595.87

5、小结

（1）在亲和素生物素参与的间接法检测人血样本实验中，rBSA Promoter能高效去除人血中正常IgG的非特异性吸附，显著降低本底噪音。

（2）rBSA Promoter能显著促进抗原抗体反应，增强阳性响应值，提高信噪比。

（3）和1%BSA系统相比，rBSA Promoter由于降低了本底信号，因此，显著提高了检测灵敏度。

（三）间接法检测人血清中抗生物肽X抗体（ACL化学发光平台）

摘要：为检测人血中抗生物肽X抗体，研究者将生物肽X标记在磁珠上，将待测样本与生物肽X磁珠反应，经洗涤后，加入鼠抗人IgG-ABEI作为检测抗体，反应后洗涤，测量发光值。由于生物肽X具有强烈的非特异吸附人血中正常IgG的能力，造成很高的本底噪音，以至掩盖了低浓度真阳性的信号值，严重降低了试剂的灵敏度。本文对比BSA和rBSA promoter对实验结果的影响，证实rBSA promoter具有出色的清除非特异背景的作用。

1、试剂材料

（1）生物肽X-磁珠

（2）鼠抗人IgG-ABEI示踪物

（3）空白人血清

（4）抗生物肽X抗体标准品:10ng/ml; 20ng/ml;100ng/ml  

2、仪器：全自动分子发光生物免疫分析仪（rightflare60pro）

3、方法与过程

（1）分别用1%BSA和rBSA promoter工作液作为反应buffer，用两种buffer各自稀释生物肽X磁珠、鼠抗人IgG-ABEI、样本，上机测试。

（2）反应流程：

1）生物肽X磁珠+样本，反应10分钟

2）洗涤

3）加鼠抗人IgG-ABEI，反应5分钟

4）洗涤

5）读发光值

4、结果

Indicator	1%BSAsystem(RLU)	rBSA Promoter(RLU)
Blank(normal serum mixture）	13081	886
10ng/ml pos S/blank	14214 1.08	1648 1.86
20ng/ml pos S/blank	14256 1.08	2966 3.34
100ng/ml pos S/blank	16512 1.26	14500 16

5、小结

（1）间接法检测人血样本实验中，rBSA Promoter能高效去除人血中正常IgG的非特异性吸附，显著降低本底噪音。

（2）和1%BSA系统相比，rBSA Promoter由于降低了本底信号，因此，显著提高了检测灵敏度。

（四）双抗体夹心法检测人血清中纳米抗体（ACL化学发光平台）

1、试剂材料

（1）SA-磁珠

（2）生物素化capture抗纳米抗体：captureAb-biotin

（3）detection抗纳米抗体-ABEI示踪物:detectionAb-ABEI

（4）空白人血清

（5）纳米抗体标准品:0.05ng/ml;0.1ng/ml;25ng/ml;50ng/ml

2、仪器：全自动分子发光生物免疫分析仪（rightflare60pro）

3、方法与过程

（1）分别用1%BSA和rBSA promoter工作液作为反应buffer，用两种buffer分别稀释SA磁珠、captureAb-biotin、detectionAb-ABEI、样本，上机测试。

（2）反应流程：

1）SA-磁珠+样本+ captureAb-biotin，反应10分钟

2）洗涤

3）detectionAb-ABEI，反应5分钟

4）洗涤

5）读发光值

4、结果

Indicator	1%BSAsystem(RLU)	rBSA Promoter(RLU)
Blank(normal serum mixture）	398	357
0.05ng/ml pos S/blank	420 1.05	1071 3.00
0.1ng/ml pos S/blank	567 1.42	1713 4.79
25ng/ml pos S/blank	267812 672	428500 1200
50ng/ml pos S/blank	334765 841	682008 1910

5、小结

（1）在亲和素生物素参与的双抗体夹心法检测人血样本实验中，rBSA Promoter能显著促进抗原抗体反应，增强阳性响应值，提高信噪比。

（2）rBSA Promoter能明显提升检测方法的线性范围。

（3）rBSA Promoter能显著降低检测下限，提高灵敏度。

（五）双抗体夹心法检测猴血中人源化双抗药（ACL化学发光平台）

1、试剂材料

（1）鼠抗人IgG-Fc磁珠

（2）羊抗人IgG-ABEI示踪物

（3）空白猴血清

（4）人源化双特异抗体药标准品:0.5ng/ml; 1ng/ml;20ng/ml

2、仪器：全自动分子发光生物免疫分析仪（rightflare60pro）

3、方法与过程

（1）分别用1%BSA和rBSA promoter工作液作为反应buffer，用两种buffer分别稀释鼠抗人IgG-Fc磁珠、羊抗人IgG-ABEI示踪物、样本，上机测试。

（2）反应流程：

1）鼠抗人IgG-Fc磁珠+样本，反应10分钟

2）洗涤

3）加羊抗人IgG-ABEI示踪物，反应5分钟

4）洗涤

5）读发光值

4、结果

Indicator	1%BSAsystem(RLU)	rBSA Promoter(RLU)
Blank(normal serum mixture）	1628	569
0.5ng/ml pos S/blank	1619 0.99	910 1.59
1ng/ml pos S/blank	1705 1.05	1639 2.88
20ng/ml pos S/blank	37109 22.79	36108 63.45

5、小结

（1）和BSA相比，在双抗体夹心法检测猴血中双抗药实验中，rBSA Promoter能高效降低非特异性吸附，显著降低本底噪音。

（2）rBSA Promoter能提高信噪比，和BSA体系相比，显著提升了检测灵敏度。

（六）BSA体系和rBSA promoter体系低端质控准确度对比

摘要：在免疫检测定量分析中，由于标曲低浓度点和质控低浓度点信号值低且精密性较差，导致低端质控点回算时，准确度较差。rBSA promoter体系能够大幅提升信噪比，稳定低浓度样品信号值，从而提升低值质控的准确度。

1. 双抗体夹心法检测人血清中纳米抗体低值质控的准确度对比（ACL化学发光法）

反应体系	质控品真实浓度	质控品信号值复孔CV	质控品回算浓度	准确度
1%BSA体系	100pg/ml	14%	81	81%
rBSApromoter体系	100pg/ml	7%	92	92%

 

2. 双抗体夹心法检测人血浆中治疗性多肽疫苗低值质控确度对比（ACL化学发光法）

 

 

 

反应体系	质控品真实浓度	质控品信号值复孔CV	质控品回算浓度	准确度
1%BSA体系	2ng/ml	13%	1.65ng/ml	82%
rBSApromoter体系	2ng/ml	8%	1.86ng/ml	93%

3. 双抗体夹心法检测人血清中IL-6低值质控准确度对比

反应体系	质控品真实浓度	质控品信号值复孔CV	质控品回算浓度	准确度
1%BSA体系	20pg/ml	14%	16.7pg/ml	83%
rBSApromoter体系	20pg/ml	8%	21pg/ml	105%

结论：rBSA promoter体系能提高低值质控品的准确度，降低分析批报废率。

（七）间接法检测人血清中抗VEGF抗体（ELISA平台）

1、试剂材料

（1）VEGF Ag包被板（costar plate）

（2）1%BSA buffer; rBSA promoter buffer

（3）羊抗人IgG-HRP酶结合物

（4）空白人血清

（5）抗VEGF标准品:2ng/ml 

（6）TMB显色剂

（7）终止剂

2、仪器：Multiskan FC

3、方法与过程

（1）分别用10%胎牛血清（10%FCS）、1%BSA和rBSA promoter工作液作为样品稀释液，稀释空白人血清和标准品，封闭液和酶稀释液用1%BSA。对比三者的本底及阳性响应值。

（2）反应流程：

1）样本1：10稀释后，加入VEGF Ag包被板，室温反应120分钟

2）洗涤

3）加入羊抗人IgG-HRP酶结合物，室温反应120分钟

4）洗涤

5）加入显色剂，室温避光反应10分钟，终止后酶标仪读值

4、结果

 

Indicator	10%FCS Sample-dilution    (Abs)	1%BSA Sample-dilution    (Abs)	rBSA Promoter Sample-dilution (Abs)
Blank(normal serum mixture）	0.196	0.209	0.052
2ng/ml pos	0.232	0.306	0.356
POS/blank	1.18	1.46	6.85

5、小结

（1）在间接法检测人血清中抗VEGF抗体的ELISA实验中，和常用的10%FCS、1%BSA相比，rBSA Promoter用作样品稀释液，能高效去除人血中正常IgG的非特异性吸附，显著降低本底噪音。

（2）rBSA Promoter能促进抗原抗体反应，增加阳性响应值。

（3）rBSA Promoter用作样品稀释液，其阳性标准品与阴性血清的信号比值分别是1%BSA、10%FCS的4.7倍、5.8倍，能显著提升试剂的分析灵敏度。