Nat Commun | 赵晓航/孙伟团队发表基于尿蛋白图谱的CRC诊断及转移风险分层研究
结直肠癌（CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤，也是癌症死亡的第二大原因。值得注意的是，目前临床上主要根据是否存在区域淋巴结转移（LNM）和远处转移（DM）对CRC进行定义，LNM与DM是患者生存和复发最直接相关的预后因素。
虽然影像学和血清癌胚抗原（CEA）检测在CRC的复发和转移监测中发挥着重要作用。但这些主流检测方法仍存在一些缺陷，例如影像学的高成本、对小淋巴结或病变漏诊及CEA对发病初期的灵敏性较低等。因此，临床上迫切需要更准确、更无创、更经济的生物标志物对CRC进行诊断和监测。
作为发现早期和敏感生物标志物的一个重要来源，尿液可以迅速反映体内的变化。此外，尿液的蛋白质组成复杂性明显低于血清或血浆，是一个很好的生物标志物分析样本。近日，中国医学科学院、北京协和医学院国家肿瘤中心/国家肿瘤临床研究中心/肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室赵晓航团队联合中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所质谱中心/蛋白质组研究中心孙伟团队，在Nature Communications发表了题为“Noninvasive urinary protein signatures associated with colorectal cancer diagnosis and metastasis”的研究文章。研究团队采用高通量蛋白组学和免疫组学技术对CRC的尿蛋白生物标志物进行鉴定，以用于CRC的诊断和转移风险分层，并在组织标本中验证了关键尿蛋白的表达，发现了更为灵敏的CRC标志物。该研究成果展示了有潜力的尿蛋白生物标记物应用价值，高度准确的尿蛋白标志物和尿蛋白组学在未来CRC研究和临床应用中将发挥重要作用。
文章发表在Nature Communications
主要研究内容
整体研究策略和患者的临床特点
该研究共纳入657名受试者，包括健康对照（HC）、无转移CRC患者（NM）以及LNM和DM CRC患者。经过严格筛后，552名个体被纳入后续分析。HC组和三组CRC患者的年龄、性别分布基本平衡。此外，三组CRC（NM、LMN、DM）的组织学分化程度、糖类抗原CA19-9（CA19-9）水平、肿瘤位置等临床参数在串联质谱标签技术检测（TMT）和平行反应监测（PRM）分析中均无统计学差异。
图1. 研究整体框架图，来源：Nature Communications
利用TMT方法发现差异尿蛋白
首先，研究团队基于36名受试者，采用TMT标记的质谱分析方法对CRC中存在的尿蛋白进行检测，最终在4个分组中分别测定了1976、2151、2634和2771个蛋白。在对四个分组995个常见蛋白进行非监督主成分分析后发现，HC组和CRC组之间存在明显的差异。随后，采用平均表达差异大于1.5倍的标准来定义NM、LNM、DM和HC之间的两两差异尿蛋白，结果共鉴定了273、337和355个蛋白。
对上述差异蛋白的信号通路分析显示，其肿瘤生长、肿瘤侵袭、免疫反应等肿瘤相关信号通路中显著富集。此外，在疾病和生物功能相关通路中，细胞死亡和凋亡相关蛋白受到抑制，而肿瘤增殖、迁移和蛋白质代谢模块中的蛋白随着CRC的发生发展逐渐被激活。因此，以上结果表明，尿蛋白组学可以反映结直肠癌肿瘤生长、恶性程度以及转移性结直肠癌的肿瘤侵袭状态。
图2. 差异蛋白富集通路分析，来源：Nature Communications
基于PRM的靶向质谱验证
随后，研究团队采用一种广泛使用的基于PRM的靶向高通量蛋白质组学技术，以定量验证差异尿蛋白。在发现阶段鉴定的CRC相关和CRC转移相关差异蛋白中，分别选择112个和54个随CRC进展呈梯度增加或减少趋势的蛋白进行PRM验证。
其中，41个差异蛋白的66个多肽成功被验证，4个分组的差异蛋白变化趋势与TMT方法检测得到的结果一致。结果显示，41个蛋白中18个蛋白随着疾病进程显著下调，23个蛋白显著上调。基于23个上调蛋白的相关性和共表达，研究团队从中排除了9个不符合筛选标准的蛋白。
研究人员利用剩余的14个蛋白作为输入变量确定了诊断模型和转移模型中最重要的特征，并检测了每个蛋白在诊断和转移风险分层中的分类性能。结果显示，8种常见尿蛋白在CRC诊断或转移风险分层中表现良好。此外，通过比较诊断和转移风险分层的联合AUC值来评估任意两种蛋白的互补性能。最后确定了3个CRC诊断蛋白标志物包括：CORO1C、ARPC5和RAD23B；4个CRC转移风险预测蛋白标志物包括：CORO1C、RAD23B、GSPT2和NDN。
图3. 基于PRM的验证及蛋白生物标志物的鉴定，来源：Nature Communications
数据显示，上述鉴定的CRC诊断生物标志物组合的特异性达88.0%，敏感度75.8%，准确率81.0%，训练集AUC为0.858。采用重采样来评估模型过拟合的程度，偏校正后的AUC为0.802，表明该模型具有良好的鲁棒性。为了评估该标志物组合在HC组中区分NM、LNM和DM组的诊断特征，两两比较的AUC分别为0.800、0.948和0.935，表明其对CRC转移有更好的预测能力。此外，上述鉴定的转移特征蛋白组合对鉴别有/无转移CRC患者的敏感性为81.1%，特异性为70.0%，准确性为77.2%，AUC为0.784。
图4. 蛋白生物标志物的性能评估，来源：Nature Communications
组织蛋白升高反映CRC晚期疾病特征和预后不良
为了评估尿液中三种诊断相关蛋白的异常改变是否来源于结直肠癌组织，研究团队在组织中进行了免疫组化染色检测。结果显示，CORO1C和ARPC5定位于细胞质，RAD23B主要定位于细胞质和细胞核。在邻近的非癌组织中，CORO1C、RAD23B和ARPC5染色相对较弱，阳性率分别为5.6%、32.7%和9.2%。与之相反，CORO1C、RAD23B和ARPC5免疫染色在CRC肿瘤组织表达明显高于癌旁组织，其阳性率分别为55.7%、84.0%、85.8%。临床意义分析显示，较高的CORO1C水平与CRC侵袭程度和远处转移有关。
图5. 诊断性生物标志物的免疫组化染色及其临床意义，来源：Nature Communications
Kaplan-Meier生存分析表明，高CORO1C蛋白水平的CRC患者无复发生存期较短，但总生存期无显著差异；RAD23B与不良总生存期显著相关，与无复发生存期无显著相关性。ARPC5在CRC中没有预后意义。综上所述，由于具有共同的诊断和转移特征，高水平的CORO1C和RAD23B表达确实促进了CRC中恶性细胞的转移潜能。
图6. 基于三种生物标志物的生存分析，来源：Nature Communications
结语
综上所述，研究团队结合定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、免疫组学等方法，系统分析了用于CRC诊断和预后预测的尿蛋白。截止到目前，该研究是确定CRC非侵袭性生物标志物最大和最全面的研究，发现在癌前病变和早期肿瘤组织中存在异常高水平的诊断相关尿蛋白生物标志物。此外，尿蛋白组能够综合反映不同的CRC分期，以及早期CRC的病理和生理变化。该研究为可靠的CRC诊断和检测提供了有潜力的尿蛋白生物标志物。
同时，研究人员表示，未来仍需使用更大的队列进行外部验证，尤其是来自多中心的外部验证，以推广该研究结论的临床使用。此外，上述蛋白生物标志物在CRC进展过程中的潜在机制仍不清楚，希望能够在未来的研究中被深入探索。
参考文献：
1. Sun, Y., et al. Noninvasive urinary protein signatures associated with colorectal cancer diagnosis and metastasis. Nat Commun 13, 2757 （2022）.
2. Bray, F. et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J. Clin. 68, 394–424 （2018）.
3. Vasaikar, S. et al. Proteogenomic analysis of human colon cancer reveals new therapeutic opportunities. Cell 177, 1035–1049 e1019 （2019）.
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