北大谢晓亮团队PNAS发文：单细胞水平实现SNV 精确检测的全基因组扩增方法META-CS
与衰老和疾病相关的单核苷酸变异（SNVs）在人类基因组中时有发生，因此进行单细胞检测具有重要意义。然而，由于细胞内单链DNA损伤和全基因组扩增（WGA）过程的影响，单细胞SNVs的检测一直存在假阳性（FPs）。其原因有：一，用于扩增的聚合酶会出错，大多数DNA聚合酶在体外DNA合成过程中，碱基替换的错误率在10−6～10−4，这表明人类基因组60亿个碱基在第一个扩增周期中就会产生数千个FPs；二，细胞裂解和扩增过程中的外力因素会导致DNA损伤，与活细胞中自然发生的损伤，均会被DNA聚合酶错误识别并转化为FPs。这些FPs导致的SNVs数量明显大于自然发生的SNVs，因此，SNVs的全基因组测定一直是一个挑战。
近日，北京大学谢晓亮团队等报道了一种单细胞WGA方法，称为互补链的多重末端标记扩增（multiplexed end-tagging amplification of complementary strands, META-CS），该方法能够在单管反应中分别标记和扩增两条DNA链，通过DNA互补性几乎消除了所有的FPs，达到了目前已有方法中最高的精确度。该项工作以“Accurate SNV detection in single cells by transposon-based whole-genome amplification of complementary strands. ”为题发表在PNAS 上。
文章发表于PNAS
由于真正的SNV必须位于两条DNA链的同一位置，但聚合酶错误和DNA损伤都只发生在一条链上。因此，通过测序后检查两条链的互补性，可以筛选出FPs（图1A）。研究团队基于先前开发的WGA方法：多重末端标记扩增（META）开发了META-CS。该方法首先利用Tn5转座将来自单细胞裂解物的基因组DNA片段化，每个片段被16个独特的转座子序列中的2个随机标记，作为后续反应的启动位点（图1B）。多个转座子序列的使用提供了片段特异性条形码，并减少了与分子内发夹结构相关的扩增损失。
接下来，通过加热使DNA片段打开，并通过两个连续的聚合酶延伸反应预扩增两条单链，以获得链特异性标记（图1C）。每轮聚合酶延伸反应后，用核酸外切酶去除多余的引物。从原始DNA的正义链和反义链中分别扩增出来的产物，可以通过与参考基因组（reference genome）的位置来区分。因此，通过两条链的信息确定SNV，精确度显著提高。此外，完整的META-CS程序在一个单管中进行，容易扩展到多孔板，简化了实验过程，减少了样品损失。
图1：META-CS对SNVs的识别 。来源：PNAS
为了评估META-CS的准确性，研究团队将人类单倍体细胞系（eHAP）中的单个祖先细胞（ancestor cell）克隆扩增5天至数百个细胞（图2A），然后通过口吸法提取了10个单细胞，并用META-CS方法进行扩增和测序。其余细胞再扩增8天至数百万个细胞后提取大量DNA，以代表祖先细胞的基因组用于接下来的比对分析。与祖先细胞相比，在单细胞中发现了新的SNVs。
研究团队首先通过对eHAP单个细胞中SNV的检测，发现SNV的数量并没有随着测序读取次数的增加而改变，这表明使用META-CS，只需4次读取就可以识别出突变，这大大降低了测序成本。
在扩增第5天的eHAP单细胞中，每个细胞可以检测到70 ± 25个SNVs（图2C），在检测到的95个SNVs中，有63个是C>A转换（图2D），这与之前报道研究结果一致。为了验证这种C>A为主的突变谱，研究团队进一步对扩增第13天的eHAP单细胞进行了测序。结果显示，在阈值相同的情况下，每个细胞平均有231 ± 65个新的SNVs，表明与第5天的细胞相比，第13天的细胞积累了更多的突变（图2E）。然而，第13天细胞的突变谱与第5天细胞突变谱几乎相同（皮尔逊相关系数r=0.995）（图2F）。
接下来，研究团队对一位50多岁健康男性捐赠者的精子细胞进行了扩增和测序，以验证META-CS是否能区分不同细胞类型的突变谱。研究人员发现平均每个精子细胞有114 ± 45个SNVs（图2G），且精子细胞的突变谱主要由C>T 和T>C转变组成，而不是C>A占优势的eHAP细胞的突变谱（图2H）。同时精子细胞的种系突变率很低，使得FPs的鉴定更加准确。简言之，在单个eHAP和人类精子细胞中鉴定的SNVs结果均验证了META-CS的准确性。
图2：在克隆扩增的单细胞和人类精子细胞中对META-CS的验证。来源：PNAS
成熟神经元中积累的体细胞SNVs被认为与衰老和神经退行性病变相关，但尚未得到验证。为了更准确地表征神经元中的突变模式，研究团队从三名过世个体脑组织中扩增了单个前额叶皮层（PFC）神经元，并进行全基因组测序。
结果显示，在19岁供者样本中检测到379 ± 66个SNVs，49岁供者样本中检测到871 ± 123个SNVs，76岁供者样本中检测到1,304 ± 202个SNVs，相当于每年增加16个SNVs（图3A）。该结果支持了神经元中SNVs随年龄增长而不断积累的结论。
PFC神经元中的SNVs主要是T>C和C>T转换（图3B），这可能是腺嘌呤和胞嘧啶脱氨基的结果。早前研究表明，人类新型突变在复制后期区域富集，可能是由于在DNA复制后期积累了单链DNA（ssDNA）。与此相反，非分裂神经元的突变在复制后期区域较少，但在转录区域会富集（图3C），这支持了成熟神经元中SNVs可能是由转录相关的DNA损伤引起的假说。而研究人员发现，与年轻人相比，76岁的老年人大脑中的ssDNA损伤显著增加（图3D）。根据突变谱分析显示，这种增加主要来自G>T颠换，是鸟嘌呤氧化为8-羟基鸟嘌呤的结果。
图3：在单个人类神经元中鉴定SNVs和DNA损伤。来源：PNAS
造血干祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs）的体细胞突变已被研究证明与血癌相关，通过对体外扩增的单细胞克隆进行DNA测序，可以对单个HSPCs中的SNVs进行表征。然而，成熟的外周血细胞不能从单个细胞中扩增出来，因此尚未得到广泛的研究。为此，研究团队利用META-CS技术，对同一名精子捐赠者的53个外周血单个核细胞（PBMCs）进行了扩增和测序。结果检测到平均每个细胞有1,494 ± 721个SNVs，PBMCs的突变主要为C>T转变（图4A），与造血干细胞的突变谱有很强的相关性（r=0.991）。与上述神经元的研究发现相反，PBMCs的SNVs基因组分布在转录区很少，在后期复制区富集（图4B），表明PBMCs中的SNVs主要来自HSPCs。
B细胞在成熟过程中会发生体细胞高突变（somatic hypermutation，SHM），导致免疫球蛋白基因的高突变率，从而微调抗体反应。在测序的15个B细胞中，研究团队鉴定出4个SHM+ B细胞，与近期一项研究结果类似，该团队发现SHM+ B细胞比其它B细胞具有更高的SNV频率（图4C）。且三核苷酸背景下突变谱的相关矩阵显示SHM+ B细胞的突变谱与其它血细胞显著不同（图4D）。除SHM+ B细胞外，其它B细胞和PBMCs的突变谱比T细胞更接近HSPCs。
图4：不同类型细胞中SNVs的突变频率和突变谱。来源：PNAS
综上所述，该研究团队提出的单细胞全基因组扩增方法META-CS，利用双链DNA中两条链的互补性，实现了SNV更加精确的鉴定，并在人类多种细胞类型中成功验证。与已有方法相比，META-CS不局限于二倍体细胞，对单倍体细胞或非整倍体的癌细胞同样适用，且只需四次读取就可以识别出突变，这大大降低了测序成本。因此，该方法的建立对发育、衰老和癌症等疾病的深入研究具有重要意义。
参考文献：
Xing D, Tan L, Chang CH, Li H, Xie XS. Accurate SNV detection in single cells by transposon-based whole-genome amplification of complementary strands. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Feb 23;118(8):e2013106118. doi: 10.1073/pnas.2013106118. PMID: 33593904.
an L, Xing D, Chang CH, Li H, Xie XS. Three-dimensional genome structures of single diploid human cells. Science. 2018 Aug 31;361(6405):924-928. doi: 10.1126/science.aat5641. Epub 2018 Aug 30. PMID: 30166492; PMCID: PMC6360088.
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