空间组学再添新维度！耶鲁大学樊荣团队开发“空间表观组学技术”hsrChST-seq
背 景 介 绍
染色质状态是决定基因发挥特定功能的重要因素，其在不同细胞类型中可被动态调节。最近大规模并行单细胞测序方面取得了突破性进展，也使单细胞的表观基因组研究成为可能。与此同时，研究人员也越来越认识到，组织器官中单细胞的空间信息对于理解生物学过程和疾病发病机制同样重要。然而，这些关联的位置信息在目前的单细胞表观基因组数据中是缺失的。
最近，空间解析转录组学的出现解决了这一难题，2020年11月，耶鲁大学樊荣教授团队开发了一种名为DBiT-seq（Deterministic Barcoding in Tissue for spatial omics sequencing) 的空间组学测序技术，通过组织中的确定性条形码进一步将其扩展到转录组和一组蛋白质的协同映射（详情请点击本公众号前期文章：Cell | 耶鲁大学樊荣团队开发新型空间多组学研究利器DBiT-seq，成功解析小鼠胚胎空间分布特征）。但是，时至今日，在组织切片上进行空间表观基因组测序仍然是不可企及的。
为了克服这一瓶颈，同样是耶鲁大学樊荣教授团队，近期在bioRxiv在线报道了一种名为高空间分辨率染色质修饰状态分析测序（High-spatial-resolution chromatin modification state profiling by sequencing, hsrChST-seq）这一全新的空间表观基因组测序技术，并利用该技术对小鼠胚胎或嗅球的空间染色质状态进行解析，揭示了组织类型特异性的表观遗传调控，为具体的组织类型提供了更加全面的空间解析的全基因组轮廓。这种空间染色质状态分析为研究表观遗传调控、细胞功能及其命运决定、正常生理和疾病发病机制等提供了前所未有的有力工具。
文章发表在bioRxiv
主 要 内 容
hsrChST-seq原理及基本步骤
hsrChST-seq主要包含以下几个步骤：首先，用甲醛将组织切片轻轻固定在标准胺化玻璃载玻片上。然后，添加目标组蛋白修饰抗体，紧接着添加二抗用以增强pA-Tn5转座子的结合力。随后，通过添加Mg++来激活组织中的转座子，期间，包含连接器的adapter被插入到基因组DNA的组蛋白标记抗体识别位点。接下来和之前报道的DBiT-seq工作原理相似，即通过微通道将一组DNA条形码A溶液引入组织切片，进行原位连接，并获得一个独特的空间条形码Ai（i = 1-50）。然后，第二组Bj（j = 1-50）条形码同样以微通道引入组织切片，不过其垂直于第一组条形码，两组条形码在交叉点连接起来，形成一个组织位点，每个位点都包含一个独特的条形码Ai和Bj组合，用以表征位置信息。被处理的组织载玻片在每次标记后会进行成像，这样组织形态就可以与空间表观基因组图相关联。最后，通过逆转录收集集DNA片段，用PCR扩增完成文库构建及后续的测序。
图1. hsrChST-seq基本步骤示意图，来源：bioRxiv
hsrChST-seq性能的评估
为了检测hsrChST-seq的性能，研究人员在E11小鼠胚胎中使用针对H3K27me3（抑制位点）、H3K4me3（激活启动子）和H3K27ac（激活增强子和/或启动子）的抗体进行hsrChST-seq。首先，他们评估了空间表观基因组测序数据的质量。在50μm分辨率的hsrChST-seq实验中，在每个位点共获得了9788（H3K27me3）、16135（H3K4me3）或24663（H3K27ac）的特异片段，其中28%（H3K27me3）、34%（H3K4me3）或15%（H3K27ac）片段落在峰值区域内，说明基因组序列的高覆盖率和低背景水平。为了验证其准确性，研究人员还将hsrChST-seq与已被广泛应用的非空间表观组测序方法（scCUT&Tag和ENCODE bulk ChIP-seq）进行了比较，并得到了很好的验证。这表明hsrChST-seq不仅提供了空间信息，而且具有更好的性能和数据质量。后续20μm分辨率的hsrChST-seq实验同样可以得到上述结论。
图2. hsrChST-seq测序数据质量评估，来源：bioRxiv
在确定了测序数据质量后，研究人员希望可以通过染色质状态来区分不同的细胞类型，为此，他们对数据进行了降维及分群，并将分群的结果映射回原有的空间位置。结果显示，基于测序数据的分群能够得到与相邻组织切片的H&E染色相一致的空间独特模式。具体表现为：Cluster 1（H3K27me3）和Cluster 6（H3K4me3）代表小鼠胚胎中的心脏；Cluster 2（H3K27me3和H3K4me3）和Cluster 4（H3K27ac）是肝脏特异性群体；Cluster 8（H3K27me3）、Cluster 3（H3K4me3）和Cluster 1（H3K27ac）与前脑相关；Cluster 9（H3K27me3）、Cluster 5（H3K4me3）和Cluster 3（H3K27ac）是中脑；Cluster 11（H3K27me3）、Cluster 8（H3K4me3）和Cluster 2（H3K27ac）是后脑。上述结果表明，hsrChST-seq能够以高空间分辨率解析主要组织结构。
为了对hsrChST-seq数据进行基准测试，他们使用已经发表的器官特异性ChIP-seq数据投影到已经降维分群的UMAP图上。总体而言，聚类识别与ChIP-seq数据投影匹配良好。
图3. E11小鼠胚胎的hsrChST-seq及分析，来源：bioRxiv
此后，他们在20μm分辨率的hsrChST-seq对E11小鼠胚胎的脑部进行分析，无监督的聚类分析显示出不同的空间格局修饰，H3K27me3识别出了大多数Cluster 。进一步的分析发现，H3K27me3具有不同的修饰模式，除前脑部分外，Cfap77被广泛抑制；参与肢体发育的Six1在Cluster 5中染色质沉默分数较低。虽然Sfta3-ps和Rhcg只在前脑中缺乏H3K27me3富集，但它们都有明显的空间分布。各亚群的高表达差异基因通路富集分析显示，Cluster 1主要参与前脑发育，Cluster 4与心脏形态发生相关，这些均与解剖学注释一致。
图4. E11小鼠胚胎的hsrChST-seq及分析，来源：bioRxiv
另外，他们还用免疫荧光染色的组织切片证实了hsrChST-seq的高性能。首先，小鼠嗅球组织切片用蓝色核DNA染料DAPI染色。然后，H3K27me3抗体被用来进行hsrChST-seq，结果表明其可区分主要的细胞类型，包括肾小球层（cluster 1）和颗粒层（cluster 2）。下图G表明hsrChST-seq得到的H3K27me3修饰模式和原位杂交的验证一致。同时，在同一组织载玻片上，免疫荧光和hsrChST-seq的结合可以原位提取单细胞表观基因组数据，而不需要分离组织。
图5. hsrChST-seq细胞水平的映射，来源：bioRxiv
hsrChST-seq与scRNA-seq数据的整合分析
最后，为了将细胞类型映射到hsrChST-seq数据上，他们将H3K4me3和H3K27ac数据与单细胞转录组数据整合在一起进行分析。结果显示，空间组织信息能够很好地与单细胞转录组分群进行匹配，这也提示，该技术可以使细胞类型注释从单细胞转录组数据提升到组织中的空间位置，并进一步得到染色质修饰状态。他们利用检测到的几种器官特异性细胞类型对两组的映射进行了验证：对早期胚胎红系发育至关重要的红细胞只在肝脏中富集；心肌细胞类型仅在心脏区域观察到；软骨细胞和成骨细胞在胚胎面突中广泛可见；抑制性中间神经元在中脑和后脑中高度富集；在前脑区可见丰富的少突胶质细胞祖细胞，这些与解剖注释一致。简而言之，单细胞转录组数据与空间表观组学整合能够对细胞类型进行更加准确的定义，并可得到染色质修饰状态的空间分布信息。
图6. hsrChST-seq与scRNA-seq数据的整合分析，来源：bioRxiv
研 究 总 结
综上所述，该研究证明了在组织切片原位分析高空间分辨率的染色质状态是可行的，而且这种基于二代测序技术的方法是在全基因组层面进行的，无偏倚性，可用于解析组织环境中的生物分子机制。
这一技术的应用将使分子生物学从单个细胞的表观基因组、转录组和蛋白质组提升到空间层面，对组织如何分化发育和疾病如何发展具有广泛的揭示意义。同时，该方法的通用性和可扩展性可以加速在组织水平和细胞水平上绘制染色质状态，以显著丰富细胞层面的空间表观基因组，为空间生物学增加了一个新的维度。
参考文献：
1、https://doi.org/10.1101/2021.03.11.434985.
2、Liu et al., High-Spatial-Resolution Multi-Omics Sequencing via Deterministic Barcoding in Tissue, Cell (2020). Published online Nov 13, 2020.
3、O. Schwartzman, A. Tanay, Single-cell epigenomics: techniques and emerging applications. Nature Reviews Genetics 16, 716-726 (2015).
4、G. Kelsey, O. Stegle, W. Reik, Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future. Science 358, 69 (2017).
5、D. U. Gorkin et al., An atlas of dynamic chromatin landscapes in mouse fetal development. Nature 583, 744-751 (2020).
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