技术简介

根据基因的结构特征，选择整个基因，基因组序列作为敲除区域，在基因的5'和3’UTR区域设计相应的sgRNA，同时构建含与敲除基因5'和3’临近区域同源的Donor质粒，将Cas9，两条对应的sgRNA和Donor共转染目的细胞，通过sgRNA引导Cas9核酸酶对目的基因靶位点进行切割，引起DNA双链断裂(Double-strand  breaks，DSB),通过细胞自身的同源重组修复（Homology-directed  repair，HDR)途径，将Donor质粒重组到目的细胞的基因组中，造成目的基因在基因组序列上的完全敲除，达到基因的完全敲除的效果

应用范围

方案选择

应用案例

细胞名称：Thp-1

基因名称：MIR3945HG

项目方案：构建Cas9/sgRNA过表达质粒和含Donor片段的过表达质粒，转染Thp-1细胞，再通过流式分选对GFP和mCherry阳性的细胞进行筛选，挑单克隆经鉴定后进行扩增，得到MIR3945HG全基因敲除的单克隆细胞株。

阳性细胞鉴定：通过对流式分筛选出的单克隆细胞进行PCR及测序鉴定，MIR3945HG基因整个转录本缺失，MIR3945HG基因在功能上到达完全敲除的效果。

项目流程与周期

交付标准

        点突变是指基因序列中单个核苷酸碱基的改变。突变发生的位置对基因功能的影响大小不一。对非编码基因而言，大多数点突变没有什么影响；当突变位点位于基因启动子序列中时，则可能影响基因的表达；当发生在内含子剪接位点时，则可能会干扰RNA的正确剪接；当发生读码框内时，可能仅仅引起一个氨基酸的改变而改变整个蛋白的结构和功能。

        从进化论的角度看，点突变既可能是有益的也可能是有害的。有益的突变使个体产生优势，并将该特性传给后代，从而使整个种群得到改善；有害突变会导致个体死亡，或通过自然选择的方式使其繁殖能力大大降低从而被淘汰。而大多数情况下我们更关注因点突变引起的疾病，如遗传性疾病镰刀性贫血症以及各种肿瘤。

      通过构建点突变细胞株，可以进行单核苷酸多态性、遗传性疾病、肿瘤等的研究，也能用于靶向药、基因疗法的开发。基于大量项目的经验，睿远能够提供同源重组、单碱基编辑、先导编辑等多种技术，能够实现几乎所有位点基因突变细胞株的构建。

技术简介

同源重组技术

      利用CRISPR/cas9技术，设计并构建cas9/sgRNA和含目的基因点突变的供体载体（Donor），将CAS9/sgRNA和Donor质粒共转染目的细胞，通过sgRNA引导Cas9核酸酶对目的基因位点进行切割，引起DNA双链断裂（Double  strand  breaks    DSB)，细胞以Donor作为模板进行同源重组修复（HDR),将目标点突变重组到基因组靶位点，从而获得目的基因点突变的细胞系。

Base  editing  技术

        单碱基编辑技术是一种基于核酸酶失活的CAS9(dcas9）或cas9切口酶（cas9n）、胞嘧啶脱氨酶（APOBEC1)或腺嘌呤脱氨酶（TadA)以及sgRNA形成的复合体，在不断裂DNA双链的情况下，利用sgRNA将复合体靶向与sgRNA互补配对的基因组靶位点，对靶向位点进行精准编辑，实现在活性窗口内C-T、G-A、A-G,T-C的单碱基转换

Prime   editing技术

    Prime  editing（PE)系统是在原有的CRISPR/CAS9体系基础上进行改造开发出来的基因编辑系统，该系统包括2个元件：pegRNA（prime  editing  guide  RNA）和nCas9(H840A)-M-MLV逆转录酶的融合蛋白。psgRNA是一段改造后的sgRNA，它在传统sgRNA的3‘末端增加了一段RNA序列。pegRNA由3个部分组成，包括Single-guide  RNA(sgRNA)、引物结合位点（Prime  Binding  site）PBS和储存有靶向位点编辑信息的逆转录模板（RT-template）。在pegRNA的引导下，融合蛋白会靶向sgRNA互补配对的基因组靶位点，并对含PAM的靶DNA链进行切割（pegRNA的非互补链）。随后，PBS序列与被切割的目标DNA链互补配对，逆转录产物（DNA）包含我们所需要的突变位点。这段逆转录DNA会入侵并进入基因组DNA发生整合，细胞利用体内修复机制对整合DNA切口进行修复，使所需要的突变位点整合到基因组靶位点，从而获得目的基因点突变的细胞系。

应用范围

方案选择

应用案例

细胞名称：Hep  G2

基因名称：CYP3A5

项目方案：根据CYP3A5基因突变位点序列设计sgRNA，利用CRISPR/CAS9对目的位点进行切割，引起DNA双链断裂，通过同源重组的方式将含有突变位点rs776746（A>G)的目的片段引入指定位点，通过GFP标签筛选出CYP3A5的单克隆细胞。

    阳性细胞鉴定：通过对流式分选筛选出的单克隆细胞进行PCR及测序鉴定，CYP3A5基因rs776746位点A成功突变为G

项目流程与周期

交付标准

产品简介：

番红固绿染色可以很好的显示软骨各层和潮线结构，因其可以直观反映关节软骨、软骨下骨和骨组织的结构而备受青睐，是一种常规的研究软骨染色的方法。本公司生产的番红固绿染色液显示软骨基质呈均匀的红色，成骨呈绿色，软骨组织与骨组织分对比鲜明。

保存条件：

　　常温保存，有效期12个月。

　　使用方法：

　　1.石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75%酒精5min，自来水洗。

　　2.固绿染色：切片入骨组织固绿染色液1-5min，水洗去多余染液，至软骨呈无色，苏木素分化液(G1039)稍浸泡10s，自来水稍洗。

　　3.番红染色：切片入骨组织番红染色液1-5s，四缸无水乙醇快速脱水分别5s、2s、10s、第四缸镜检。

　　4.透明封片：干净的二甲苯透明5min，中性树胶封片。

　　5.显微镜镜检，图像采集分析。

　　染色结果：

　　软骨呈鲜红色，成骨呈绿色。有些结缔组织也呈红色。

　　注意事项：

　　1.片子染色不好需要重新染色时，可以用自来水浸泡去除固绿颜色，苏木素分化液(G1039)浸泡去除番红颜色，将颜色全部脱色后方可重新染色。

　　2.染色时间稍有差异红色和绿色的差异就会很大，要注意镜下控制两种颜色的程度。自来水中能分化固绿的颜色，刚染完固绿的片子软骨部位也会着上比较深的绿色，这时就需要在自来水中分化至软骨部分的绿色变浅或者变成无色。但是同时也要注意成骨部分的绿色颜色变化，如果成骨部分的颜色在分化时过浅就需要重新染固绿，再用自来水分化直至达到软骨部分绿色比较浅或者无色，成骨部分绿色较深。

　　3.番红染次数多了会产生沉淀且不易着色，需及时更换染液。

服务介绍：

　　油红O对脂滴的染色机制一般认为是物理学上的溶液作用或吸附作用，借溶液作用使脂质染色，即油红O先溶于60%异丙醇中，然后切片浸入油红O染液中时，油红O在组织脂质的溶解度较60%异丙醇中的溶解度高，所以在染色时油红O从60%异丙醇中转移入脂质中使脂滴显示红色

　实验流程：

　　冰冻切片晾干-油红染色-分化-苏木素染色-分化-返蓝-甘油明胶封片-显微镜镜检。

结果判读：

　　脂滴橙红色至鲜红色，细胞核浅蓝色

　送样运输要求：

1、样本放置于20倍样本体积的固定液中固定24h以上，常温运输送样。

切勿固定时间过长，切勿冷冻结冰；

2、新鲜组织干冰运输。

3、冰冻切片-20℃运输。

服务介绍：

　　苏木精-伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ，简称HE染色法 ，石蜡切片技术里常用的染色法之一 。苏木精染液为碱性 ，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色 ;伊红为酸性染料 ，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色 。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。

　实验流程：

　　脱蜡至水-苏木素染色-伊红染色-脱水封片-显微镜镜检

送样运输要求：

　　样本放置于20倍样本体积的固定液中固定24h以上，常温运输送样。

　　切勿固定时间过长，切勿冷冻结冰。

Western blot 实验简介

　　是指通过SDS-PAGE 胶将不同分子量的蛋白分离开，然后将目标蛋白转移到PVDF 膜上，再利用抗原抗体的特异性结合，用特异性的一抗结合目标蛋白，用HRP 标记的二抗结合一抗，再加以ECL 发光液显色，检测目的蛋白在不同处理的样本中表达量的高低变化。

技术简介

       细胞中有一类基因是维持存活必不可少的，称为必需基因。直接敲除必需基因会导致细胞死亡，因而无法获得目的基因敲除的细胞。条件性敲除为研究这一类基因的功能提供了帮助。

       条件性基因敲除主要通过染色体位点特异性重组酶系统实现，如Cre-loxp，Flp-FRT,Dre-Rox等，其中最常用的是Cre-loxp系统。在待敲除目的基因序列两端各插入一个loxp序列，得到Floxed（flanked  by  loxp）细胞。在细胞未表达CRE重组酶时，该基因是正常表达的。当细胞中转入Cre重组酶后，两个loxp位点之间的序列会发生重组删除，从而实现目的基因的敲除，研究人员可以在基因敲除到细胞死亡这段时间内进行观察和研究。

应用范围

方案选择

应用案例

   细胞名称：C3H10T1/2

  基因名称：Ndufa13

   项目方案：构建Cas9/sgRNA和Donor质粒，转染目的细胞，通过流式分选GFP和mCherry阳性细胞，挑选单克隆，经鉴定后进行扩增，得到Ndufa13基因条件性敲除的单克隆细胞株。

阳性细胞鉴定：通过对流式分选筛选出的单克隆细胞进行PCR及测序鉴定，Ndufa13基因第3外显子两侧的内含子中各插入一个loxp，获得Ndufa13条件性敲除的单克隆细胞株。

项目流程与周期

交付标准