I 简介

立沃生物科技是一家专注于原代细胞分离、冻存与再生的技术型企业。我们的原代胰岛细胞分离自SPF级小鼠，所有材料来源清晰，各种品系都可。我们的细胞产品经过多种测试，复苏后细胞活力高、细胞团完整且边缘光滑、功能完善，可广泛应用于基础生命科学研究以及药物研发中。

II  试剂与材料

-小鼠胰岛细胞（Cat# LV-mPICs003）         

-复苏培养基（Cat#LV-Rec001）

-胰岛细胞维持培养基（Cat# LV-mPICM003）    

-D-hank’s液

-生物安全柜                               

-无菌15mL离心管           

-移液枪                               

-恒温水浴锅          

-37℃/ 5% CO₂培养箱                       

-非TC-treated 10cm细胞培养皿

-宽口移液枪头（普通移液吸头去尖，再灭菌使用）

-细胞培养瓶（板）

-FDA/PI（荧光素双醋酸酯/碘化丙啶）

-0.25% trypsin-EDTA

-GSIS试剂盒

III 细胞的复苏与铺板

将胰岛细胞复苏培养基和维持培养基于38℃恒温水浴锅中预热20min。

生物安全柜中，在非TC-treated 10cm细胞培养皿中加入10mL胰岛细胞复苏培养基，备用；

将冻存的人胰岛细胞从冷藏位置迅速转移至38℃恒温水浴锅中，尽可能多的浸入38℃水中并顺时针旋转解冻，但必须确保冻存管盖子保持在水面以上。

解冻冻存管约90-120s，至冻存管中只有小块碎冰漂浮即可。

 

用75%酒精消毒冻存管，并将其转移到生物安全柜。

 

用宽口枪头吸出细胞，并轻柔地滴加到含预热的10mL胰岛细胞复苏培养基的非TC-treated 10cm细胞培养皿中（注意：

 

冻存管与枪头上残留细胞，可用复苏培养基清洗冻存管与枪头，合并到非TC-treated 10cm细胞培养皿中）。

将细胞培养皿前后左后轻柔晃动2-3次后室温放置30min。

取适量细胞用FDA/PI（荧光素双醋酸酯/碘化丙啶）染色观察胰岛细胞的死活情况。

步骤7所得细胞得到的细胞，根据具体实验用途选择合适的处理方式（以下处理仅供参考）。

a. 胰岛细胞：在体式显微镜下，用20μL吸头挑取完整性较好的胰岛细胞作处理。

a.1 葡萄糖刺激下的胰岛素分泌实验（GSIS）：具体操作参见GSIS试剂盒说明书。

a.2 胰岛细胞培养：可根据实验要求，选择不同规格的细胞培养瓶或细胞培养板。若需要贴壁培养，则选择TC-treated细胞培养瓶（板）；若需要悬浮培养，则选择非TC-treated细胞培养瓶（板）；胰岛细胞培养的密度建议为10-20个/mL胰岛细胞维持培养基，3-4天半量换液，7天一次全量换液。可根据具体实验要求，在胰岛细胞维持培养基中添加不同成分。

a.3 胰岛细胞移植：根据不同受体和移植位点的需求或者具体实验要求，挑取指胰岛当量（IEQ）的胰岛细胞，移植到指定受体的具体移植位点中，每天监测受体的血糖变化和身体状况并作记录。

b. 胰岛单细胞：

b.1 将第7步中的胰岛细胞收集到15mL离心管中，500×g常温离心5min，完全弃掉上清，然后以5mL预热的D-hank’s液重悬，500×g常温离心5min，完全弃掉上清。

b.2 加入10-20倍细胞沉淀体积的0.25% trypsin-EDTA消化液重悬，37℃孵育5min，然后于生物安全柜中用200μL吸头轻柔吹吸打散30s，继续37℃孵育3min和吹吸打散30s，直至肉眼不可见团状胰岛细胞（注意：消化总时长勿超过20min，以免细胞活性过低）。

b.3 加入5倍消化液体积的胰岛细胞维持培养基终止消化，500×g常温离心5min，完全弃掉上清，适量维持培养基重悬。

b.4 用台盼蓝排除法测定胰岛单细胞的存活率和细胞总量。

b.5 根据具体实验要求，对胰岛单细胞进行相应的处理。胰岛单细胞按5-10×10⁴/mL的密度进行培养。